有機廢棄物發酵處理專用微生物菌種的開發

朱劍鋒，祁姣姣，靳改改，曾凱斌，庫靜雅，高小菲，馬澤誠，王計偉，胡文鋒,*

（1.生物源生物技術股份有限公司，廣東 深圳 518118；2.華南農業大學，廣州 510642；3.安佑集團研究院微生物研究所，江蘇 太倉 215400）

有機廢棄物主要包括餐廚垃圾、畜禽糞便、植物殘余物、動物尸體等，含有大量的營養物質，如果處理不當，極易腐爛變質，散發惡臭，傳播細菌和病毒，破壞生態環境，造成污染[1-2]。利用微生物發酵將有機廢物轉化為廉價、營養豐富、更易吸收的蛋白質飼料，不僅能夠提高資源的利用效率，而且對消除環境污染、改善生態環境都具有重要意義[1,3-4]。

目前市售有機廢棄物發酵菌種，發酵時間長，對于纖維類含量高的原料如豆渣，多采用霉菌等絲狀真菌進行固態發酵[5-7]。然而，霉菌繁殖時，會產生大量菌絲，使發酵物料固化，這不利于昆蟲等飼喂。另外一些霉菌如用于豆渣發酵的白地霉，存在安全性爭議[8]。本研究旨在采用乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌、復合酶等，對有機廢棄物進行發酵，以達到縮短其發酵時間、提高酸溶蛋白、還原糖等小分子營養物質含量，利于其儲存，方便和安全飼喂的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑及菌種

10126U纖維素酶，山東澤生生物科技有限公司；餐廚余：由深圳市朗坤生物科技有限公司提供。豆渣：本試驗所用的豆渣，是含水量約為73%的新鮮豆渣經烘干后，無菌條件下加入無菌水得到的，其含水量、物理特性等基本特性與其新鮮狀態一致。試驗所需菌種，均為市售商品化菌粉（布拉迪酵母，2.00×1010cfu·g-1；啤酒酵母，2.00×1010cfu ·g-1；植物乳桿菌，1.00×1011cfu· g-1；鼠李糖乳桿菌，1.00×1011cfu·g-1；干酪乳桿菌，1.00×1011cfu· g-1；地衣芽孢桿菌，1.00×1011cfu ·g-1；枯草芽孢桿菌，1.00×1011cfu·g-1；納豆芽孢桿菌，1.00×1011cfu · g-1）。

1.1.2 主要儀器設備

YSQ-LS-SII全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；FE20 pH計，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；二合一臭味檢測儀，深圳市沃賽特科技有限公司。K9840自動凱式定氮儀，上海還能實驗儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定方法

水分測定參照GBT6435-2014，還原糖和總糖采用3,5-二硝基水楊酸法，粗蛋白質測定采用凱氏定氮法，具體操作和計算參照GB/T 6432—1994。粗脂肪測定參照GBT6433-2006，霉菌總數測定參照GBT13092-2006，NH4及H2S通過臭味檢測儀自動測定，AS測定參照GB/T13079-2006，Pb測定參照GB/T13080-2004。

pH的測定：每次測pH前要先把儀器用校準液校準，每個樣品取1 g試樣加99 mL蒸餾水或自來水，靜置15 min，測定pH，測完pH要把儀器的筆插入保護液中。

酸溶性蛋白含氮量測定方法：稱取樣品干樣2.00 g，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液10 mL，混合均勻，靜置5 min[9]。將溶液定量轉移，4 000 r·min-1離心10 min后，取5 mL上清液放入凱氏燒瓶中，采用凱氏定氮法測定含氮量，具體操作和計算參照GB/T 6432—1994。

活菌計數：取相應的試樣,加入帶玻璃珠的10 mL的無菌水中，200 r·min-1振蕩30 min，為待測試樣液。采用十倍稀釋法，取3個適宜稀釋度，分別移取100μL于相應的固體培養基表面（酵母菌采用PDA培養基，乳酸菌采用MRS培養基；芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，采用LB培養基），用玻璃棒輕輕地將菌懸液均勻地涂抹于培養基表面。芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌于37℃恒溫培養24 h，乳酸菌于30℃培養48 h，酵母菌于28℃培養24 h，取長有30～300個菌落的平板計數。試驗重復3次，同時做空白對照。

1.2.2 菌種有效活菌數的檢測

菌種有效活菌數的檢測見1.2.1活菌計數方法。

1.2.3 菌種頡頏作用探究

分別稱取適量菌粉加入無菌液體培養基中（酵母菌采用PDA培養基，乳酸菌采用MRS培養基，芽孢桿菌采用LB培養基），恒溫培養0.5～1 h。將活化好的菌液，以“口”型劃線于MRS瓊脂平板上（經預試驗判定，試驗所用菌種均能在MRS固體培養基上生長），34℃恒溫培養，觀察。

1.2.4 菌種初篩試驗設計

菌種初篩見表1。按表1中的劑量水平配置成相應的發酵專用菌粉。將新鮮餐廚余加入麥麩，調節其水分為55%，分別加入各菌粉，攪拌均勻，37℃發酵15 h，后轉移到30℃的培養箱中繼續發酵33 h。

另外，將上述菌粉加入少量無菌水中（含有玻璃珠），37℃，150 r·min-1活化2 h，和豆渣攪拌均勻進行發酵。發酵過程為37℃，發酵24 h，后轉移到30℃的培養箱中繼續發酵24 h。

發酵結束后，測定其pH、NH3、H2S。然后，將其置于65℃烘箱中烘至水分約10%，測定還原糖、酸溶蛋白含量。

表1 菌種初篩

1.2.5 菌種復合酶發酵試驗設計

上述試驗中有機廢棄物中豆渣沒有發酵起來，下面在投料中加入纖維素酶和木瓜蛋白酶，幫助分解豆渣中的纖維素，為酵母菌和乳酸菌提供更多的能量。采用正交表L32（49）設計試驗，見表2。發酵過程同1.2.4。

表2 試驗設計

1.2.6 發酵中試試驗設計

采用麥麩分別調節餐廚余水分55%、豆渣水分60%，接入最優比例菌粉，豆渣的發酵過程為37℃，發酵24 h，后轉移到30℃，的培養箱中繼續發酵24 h。餐廚余發酵過程為37℃，發酵15 h，后轉移到30℃的培養箱中繼續發酵30 h。發酵結束后，測定pH、還原糖、酸溶蛋白、NH3、H2S及霉菌總數、芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌，大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌數和重金屬（AS、Pb）含量等指標。

2 試驗結果

2.1 有機廢棄物理化指標檢測

餐廚垃圾、豆渣等有機廢棄物原料常規主要成分及含量檢測結果見表3。

由表3可知，餐廚余和豆渣營養豐富，餐廚余粗蛋白質含量為37.03%、豆渣粗蛋白質含量16.44%；兩者pH均＞5，同時，兩者含有大量的水分。當溫度適宜時，其會迅速滋生大量的病菌和臭味，嚴重污染環境，存在安全隱患。

2.2 菌種有效活菌數檢測

菌種有效活菌數檢測結果見表4。

2.3 菌種頡頏試驗結果

菌種頡頏試驗結果見表5。

由表5可知，植物乳桿菌對枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌均有微弱的頡頏作用，鼠李糖乳桿菌對納豆芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均有頡頏作用。

表3 餐廚垃圾、豆渣等有機廢棄物原料常規主要成分及含量

2.4 菌種初篩試驗結果

餐廚余發酵菌種初篩見表6。

由表6可知，混合菌種發酵餐廚余試驗中，沒有酵母菌的組合，均會長霉。長霉的組合，其發酵結束后還原糖含量相對其他組均高。但是長霉后，原料結塊，對于養殖是不利的。提高其還原糖的含量可以通過加入纖維素酶來達到目的。

豆渣發酵菌種初篩結果見表7。

表4 菌種有效活菌數 cfu·g-1

由表7可知，混合菌種發酵豆渣實驗中，發酵結束后，各組pH均＞5.0，顯示沒有發酵成功，根本原因是豆渣原料中含有大量的纖維、小分子還原糖含量過低（0.3365%）。芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌不能良好生長。故可以通過外加酶來達到發酵的目的。

2.5 加酶復合菌發酵試驗結果

加酶復合菌發酵餐廚余和豆渣結果見表8、9。

最優組合確定標準為，發酵結束后，各廢棄物的 4.0≤pH≤4.5，NH3＜10 ppm、H2S＜3 ppm，無異味，并具有較高的還原糖和酸溶蛋白含量。依據此標準分析如下，由表8可知，綜合考慮加酶復合菌發酵餐廚余結果，6號、9號、11號、12號、15號、16號、21號、22號、24號、25號、26號、27號、28號等組合，均為較優組合。9號、16號、21號、27號、28號為最優組合。由表9可知，綜合考慮加酶復合菌發酵豆渣結果，1號、2號、19號、25號、27號、28號、30號、31號、32號等組合，均為較優組合。27號為最優組合。

表5 菌種頡頏試驗結果

表6 餐廚余發酵菌種初篩

表7 豆渣發酵菌種初篩

表8 加酶復合菌發酵餐廚余

續表

表9 加酶復合菌發酵豆渣

綜合上述分析，27號組合（即布拉迪酵母0.125%、枯草芽孢桿菌0.03%、植物乳桿菌0.1%、纖維素酶200 U·g-1、納豆芽孢桿菌0.03%、啤酒酵母0.25%、干酪乳桿菌0.05%）為發酵有機廢棄物最優組合發酵菌粉。

2.6 發酵中試產物指標測定

發酵餐廚常規主要成分及含量見表10。

由表10可知，餐廚余經發酵后，其還原糖含量14.42%、粗蛋白質含量30.41%、小肽含量34.16%；并含有芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌。其致病菌，AS、Pb等重金屬均為檢出。經過發酵后，其營養指標得到提高，安全得到保障。

發酵豆渣常規主要成分及含量見表11。

由表11可知，豆渣經發酵后其還原糖含量5.137%、粗蛋白質含量24.45%、小肽含量42.94%；并含有芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌。其致病菌，AS、Pb等重金屬均未檢出。經過發酵后，其營養指標得到提高，安全得到保障。

表10 發酵餐廚常規主要成分及含量

表11 發酵豆渣常規主要成分及含量

3 討論與結論

試驗表明，采用布拉迪酵母0.125%、枯草芽孢桿菌0.03%、植物乳桿菌0.1%、納豆芽孢桿菌0.03%、啤酒酵母0.25%、干酪乳桿菌0.05%，纖維素酶200 U·g-1對有機廢棄物進行處理，其具有發酵速度快、物料發酵結束后疏松、營養豐富、安全等優點。

混菌發酵是利用各菌之間的相互配合作用，提高發酵效益[10-11]。本試驗選用纖維素酶制劑，可以在短時間內分解粗纖維，為芽孢桿菌的迅速繁殖提供基礎能源。特別是在處理含有高粗纖維的原料時，纖維素酶的加入對于加速發酵進程具有更顯著的意義[12-13]。芽孢桿菌分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種酶系，從而全面啟動混菌發酵。酵母菌屬于兼性厭氧菌，生活在偏酸環境中，菌體蛋白含量高達50%～60%，發酵過程產生酒香味，可以改善適口性。乳酸菌能夠將碳水化合物發酵成乳酸，同時產生細菌素、類細菌素等抑菌物質，有效抑制有害微生物的活動和有機物的急劇腐敗分解[14]。可能正是經過以上酶菌的協同作用，使得該復合菌劑處理有機廢棄物時，可達到高效、安全且產物營養豐富，更利于儲存與食用等優點。該復合菌劑對處理有機廢棄物具有積極的意義。