防逆流納米Ag-CHA-SiO2抗菌型導尿管體外生物安全性研究

孫 欣，趙 吟，裴澤軍

（無錫市第二人民醫院，江蘇無錫 214002）

0 引言

導尿管是目前臨床使用非常廣泛的一種醫用人體植入物，其在住院患者中的使用率約25%。而導尿管相關性尿路感染（catheter-associated urinary tract infections，CAUTI）隨之成為臨床治療過程中常見的一個棘手問題。根據Johnson等[1]的統計，美國CAUTI患者占醫院獲得性感染的40%，位居醫院獲得性感染的第二位，僅次于呼吸系統感染；美國每年CAUTI患者超過100萬例，占醫院獲得性尿路感染的80%。在我國，CAUTI患者占醫院獲得性感染的37.3%～56.0%，其中2%～4%的患者誘發為菌血癥和（或）敗血癥，其病死率高達13%～30%[2]。因此，CAUTI不僅給患者帶來巨大的痛苦，還給患者的生命與健康帶來潛在的威脅，此外，也無形中對衛生資源產生很大的消耗。為此，課題組創新性設計研發了防逆流納米Ag-CHA-SiO2（銀離子-醋酸氯己定-二氧化硅）抗菌型導尿管（以下簡稱“抗菌型導尿管”），以杜絕CAUTI的發生，切實保障患者安全。現對其體外抑菌能力與細胞毒性進行研究，以評價其體外生物安全性，為后期產品的轉化與開發做好準備。

1 儀器與材料

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

新西蘭雄兔[浙江省醫學科學院實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（浙）2013-0055]，大腸桿菌（ATCC11229），金黃色葡萄球菌（ATCC6538），DMEM/F12培養液（Gibco，批號8117196），胎牛血清（fetalbovine serum，FBS；四季青 11011-8611），普通 F8 醫用導尿管（以下簡稱“普通導尿管”，廣州維力醫療器械股份有限公司，5.3mm（16FR）15ml，批號 20160601），醋酸氯己定（Aladdin，批號F1606020），硝酸銀（國藥集團化學試劑有限公司，批號20160704），納米二氧化硅（先豐納米，XF105，批號100365），四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（KeyGE-NBio-TECH Cat.NO：KGA312，批號 20170303）。

1.1.2 試驗儀器

酶標儀：廠商Molecular Devices，型號SpectraMax M4；恒溫CO2培養箱：廠商Thermo，型號HEPA CLASS100；顯微鏡：廠商 OLYMPUS，型號 CKX41。

1.2 兔尿道上皮細胞的制備

新西蘭雄兔行全麻術，以膀胱組織活檢鉗夾取尿道球部腹側壁黏膜組織剪取0.4 cm×0.3 cm，迅速置入預先裝有青霉素+鏈霉素的D-hank's液，黏膜組織漂洗 2～3 遍，浸入 DispaseⅡ液（2.4 U/ml），靜置 30 min予以消化。分離提取上皮層并充分剪碎，以胰酶消化，振蕩15~20 min，加適量的D-hank's液，離心5 min（1 000 r/min），移除離心液，加D-hank's液吹打使其為單細胞懸液，用200目篩網一次性過濾，接種入T25培養瓶，加入DMEM/F12培養液，排除混雜細胞（采用差速貼壁法）。然后置于5%CO2培養箱37℃恒溫培養，2 d換液1次，當細胞增殖至70%～80%融合時以1∶3傳代培養。

1.3 樣品浸提液的制備

將普通導尿管、抗菌型導尿管分別進行紫外線照射滅菌，分別隨機截取2 cm，以6 cm2/ml的比例加入浸提液，于5%CO2培養箱37℃條件下浸提24 h，浸提介質為含10%FBS的DMEM/F12培養液，浸提后原液經一次性過濾器過濾除菌后，用于細胞毒性實驗。

2 實驗方法

2.1MTT法

依據GB/T 16886.5—2017《醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗》進行細胞形態觀察與MTT 試驗[3]。

2.1.1 細胞形態觀察

取處于對數生長期的兔子尿道上皮細胞，用胰蛋白酶進行消化，制成105個/ml的細胞懸液，用96孔型培養板接種，細胞貼壁后換液，用含10%FBS的DMEM/F12培養液（陰性對照組）及抗菌型導尿管浸提液（樣品組）、普通導尿管浸提液培養細胞（樣品組），于72 h后顯微鏡倒置觀察，拍取照片。根據細胞形態進行毒性評判[4-5]：

（1）無毒：細胞形態正常，貼壁生長好，細胞呈鋪路石狀。

（2）輕度毒性：細胞貼壁生長好，但可見少數細胞圓縮，偶見懸浮細胞。

（3）中度毒性：細胞貼壁生長不佳，細胞圓縮較多，達1/3以上，見懸浮死細胞。

（4）重度毒性：細胞基本不貼壁，90%以上為懸浮死細胞。

2.1.2 MTT試驗

MTT試驗[3]分組：以10%FBS的 DMEM/F12培養液為陰性對照組，以抗菌型導尿管浸提液、普通導尿管浸提液作為樣品組，每組各平行測試3份。根據其試劑盒操作步驟加入MTT，4 h后加入二甲基亞砜（DMSO），取酶標儀測定OD值（490 nm處）并計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）（RGR=樣品組OD值/陰性對照組OD值×100%）。根據RGB對細胞毒性進行分級[4-5]：99%≤RGR≤100%，細胞毒性為0級；75%≤RGR<99%，細胞毒性為1級；50%≤RGR<75%，細胞毒性為2級；25%≤RGR<50%，細胞毒性為3級；1%≤RGR<25%，細胞毒性為4級；0≤RGR<1%，細胞毒性為5級。0級和1級為無毒性，2級為輕度毒性或結合細胞形態綜合評價，3級和4級為中度毒性，5級為重度毒性；3~5級為不合格材料。

2.2 抑菌環試驗

根據WS/T 367—2012《醫療機構消毒技術規范》中的抑菌環操作規范[6]，以10%FBS的DMEM/F12培養液為陰性對照，對抗菌型導尿管、普通導尿管進行抑菌環試驗，每組均平行試驗3份。

2.2.1 菌種的活化

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌種（4℃保存）接種至新鮮營養瓊脂的斜面，置5%CO2培養箱18～24 h，使菌種活化[7]。

2.2.2 菌懸液制備

取典型的單菌落接種于盛有LB培養基的三角瓶中，200 r/min過夜培養；1∶100稀釋至新的LB培養基中，200 r/min培養3~4 h使細菌達到對數生長期。調整細菌濃度至 OD600=0.2±0.02（約 108 cfu/min），完成菌懸液制備[8]。

2.2.3 抑菌板制備

加熱融化培養基并分裝試管，每根試管20 ml。用橡皮塞封口，進行121℃高壓蒸汽滅菌20 min，稍冷卻，置于恒溫水浴鍋50℃保溫。在超凈工作臺上制備抑菌板[7]，每個培養皿倒入20 ml培養基，將培養皿底部全部覆蓋，吹干冷凝水。凝固后，用滅菌打孔器在制備好的平板上垂直打出3個孔，每孔直徑約6 mm，3個孔分布均勻，各孔間隔25 mm，孔洞與培養皿壁之間間隔15 mm，并用滅菌牙簽將瓊脂塊挑出。

2.2.4 菌液涂布

使用經滅菌處理的藥棉取100 μl制備好的細菌菌液均勻涂布在LB瓊脂培養基上[7]，在超凈臺中自然條件下干燥。

2.2.5 材料選取及測量

隨機截取長1 cm的抗菌型導尿管、普通導尿管插入培養基中，各樣品均平行測試3份。將培養皿放入37℃恒溫培養箱中培養24 h，卡尺量取各樣品的抑菌圈直徑。

2.2.6 抗菌性能評判

（1）陰性對照應無抑菌環；（2）抑菌環直徑≥7 mm時（即最外端向外延伸1 mm以上）即判定具有抑菌、抗菌作用；（3）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抗菌、抑菌作用，即認定該材料具有抗菌、抑菌性能[7]。

3 結果

3.1 細胞形態觀察

倒置顯微鏡濾光片顯色觀察發現，樣品組及陰性對照組72 h時后細胞均明顯增多，細胞呈正常的多變長卵形鋪路石狀，排列規則密集，未見懸浮死細胞。普通導尿管浸提液及陰性對照組未見圓縮細胞，抗菌型導尿管浸提液偶見圓形細胞，如圖1～3所示。

圖1 抗菌型導尿管浸提液細胞形態圖（100×）

圖2 普通導尿管浸提液細胞形態圖（100×）

圖3 陰性對照組細胞形態圖（100×）

3.2 MTT檢測結果

根據實驗檢測的OD值計算抗菌型導尿管浸提液、普通導尿管浸提液RGR分別為92.0%、99.5%。結合細胞形態觀察結果，抗菌型導尿管浸提液、普通導尿管浸提液MTT試驗分級分別為1級、0級，具體見表1。

表1 MTT法檢測兔尿道上皮細胞OD值、RGR和細胞毒性分級（n=3）

3.3 抑菌環試驗結果

抗菌型導尿管對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（11.24±0.54）、（7.63±0.34）mm，均＞7 mm，有抑菌、抗菌作用；普通導尿管對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均為（6.00±0.00）mm，均＜7 mm，無抑菌作用。2種導尿管對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果對比如圖4、5所示。

圖4 2種導尿管對大腸桿菌的抑菌效果對比圖

圖5 2種導尿管對金黃色葡萄球菌的抑菌效果對比圖

4 討論

細胞毒性試驗是目前一致認可的有效評價材料生物相容性的方法[9]。其中MTT法因其靈敏、客觀、重現性好而成為金標準[10]。根據實驗結果觀察比較圖1~3細胞生長形態可知，樣品組與陰性對照組比較，細胞形態均生長正常，僅抗菌型導尿管浸提液細胞緊密度略低，并偶見圓形細胞。細胞生長形態與MTT檢測結果表明，抗菌型導尿管浸提液為1級、普通導尿管浸提液為0級，均判定為無毒性材料。

抑菌環試驗結果顯示，普通導尿管對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均為（6.00±0.00）mm，＜7 mm，無抑菌作用?？咕蛯蚬軐Υ竽c桿菌的抑菌圈直徑達（11.24±0.54）mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（7.63±0.34）mm，均>7 mm，具有抑菌作用。由試驗結果可知，抗菌型導尿管對大腸桿菌的抑菌效果顯著，但對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不夠理想。鑒于CAUTI通常以革蘭氏陰性菌感染為主[11]，因此當前抗菌型導尿管能對大部分的CAUTI起到良好的預防作用，但其仍存在不足，后期應該在如何提高對金黃色葡萄球菌的抑菌效果上加以改進。考慮到Ag-CHA-SiO2中CHA具有良好的廣譜抗菌作用，后期將著重于研究CHA的含量調整與釋放度，以使抗菌型導尿管能對包括金黃色葡萄球菌在內的各種微生物起到良好的抑菌作用，達到廣譜抗菌效果。

此外，抗菌型導尿管創新性地從引起CAUTI的內、外2種途徑進行了全面防范[12]，對內部利用單向閥杜絕導尿管內部逆流污染引起的感染，對外部則通過納米Ag-CHA的復合體進行聯合抗菌，有效地提高了抗菌效果。同時納米Ag-CHA具有抗菌譜廣、不易產生細菌耐藥性等特點，適于長期使用，安全可靠。

綜上所述，抗菌型導尿管無細胞毒性，屬無毒范疇，為合格生物材料。其生物安全性能符合要求，抑菌性能良好，作用全面，值得進行轉化推廣，尤其對部隊野外操作更有優勢[13]。后續應進一步深入開展體內有效性的研究，同時進一步進行有效作用時間延長的研究，使其臨床應用效果更好，真正造?；颊摺?/p>