基于納米磁微粒化學發光技術的S100B蛋白新型檢測試劑和儀器的研究

代 晨，王 琦，江繼鵬，杜振華，汪云峰，陳凱歌，陳旭義，戰 麗，張 賽*，靳 穎*

（1.武警后勤學院附屬醫院腦科中心，武警部隊腦創傷與神經疾病研究所，天津市神經創傷修復重點實驗室，天津 300162；2.武警北京總隊十二支隊衛生隊，天津 300481；3.武警后勤學院附屬醫院檢驗科，天津 300162；4.博奧賽斯（天津）生物科技有限公司，天津 300300；5.武警后勤學院救援醫學系，天津 300162；6.武警后勤學院教學考評中心，天津 300162）

0 引言

S100B蛋白是一種鈣離子結合蛋白，主要分布在中樞神經系統的星形膠質細胞及周圍神經系統的雪旺細胞中[1]，被認為是腦的特異性蛋白[2]。正常情況下，S100B蛋白很少出現在血液中，顱腦創傷后，S100B蛋白釋放至細胞外間隙，并通過受損的血腦屏障進入腦脊液和血液[3]。S100B蛋白在監測顱腦創傷發展進程[4-5]、鑒別顱腦創傷嚴重程度[6-7]、顱腦創傷的陰性排除[8-9]等方面具有重要的臨床價值。

S100B蛋白的血清學檢測方法包括放射免疫分析法、免疫放射測定法、酶聯免疫吸附法、電化學發光法等，目前以酶聯免疫吸附法為主，但是此方法操作復雜、耗時長、自動化困難，制約著S100B蛋白在臨床的廣泛應用。基于納米磁微粒化學發光技術的S100B蛋白檢測方法具有操作簡單、檢測速度快、可實現自動化等優點。目前國內此類檢測試劑的相關報道較少，因此本文研發了相關檢測試劑和儀器。

1 方法

1.1 試劑制備

1.1.1 原理

磁微粒是磁性納米粒子與無機或有機分子結合形成的可均勻分散于一定基液中具有高度穩定性的膠態復合材料，可通過活性基團將免疫檢測中的酶、抗體等相關成分固定于其表面。納米磁微粒化學發光免疫分析技術是以化學發光劑為底物的酶免疫技術，同時應用了納米級磁性微粒做固相載體，增加了吸附面積，使抗原、抗體最大限度結合[10]，并使其結合反應在近似液相的條件下進行，兼具化學發光與酶免疫技術的優點。在反應過程中引入生物素-親和素系統，即夾心法納米磁微粒化學發光技術。夾心法納米磁微粒化學發光技術的原理（如圖1所示）：待測抗原同生物素標記的抗體及酶標抗體結合形成“三明治”結構的復合物。隨后加入連有親和素的磁微粒，通過生物素-親和素特異性結合使抗原、抗體復合物連接到磁微粒上，在外加磁場中直接沉淀，將免疫反應形成的復合物與其他物質分離。去上清后，清洗沉淀的復合物，加入酶促化學發光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基態時發出光子，通過光量子閱讀系統記錄光子強度，經過計算機處理系統將光能量強度在標準曲線上轉換為待測抗原的濃度，并報告結果。

圖1 夾心法納米磁微粒化學發光技術檢測原理

1.1.2 制備

試劑包括R1、R2、R0試劑和校準品。

R1[生物素（Biotin）-S100B 蛋白單克隆抗體]試劑的制備：將S100蛋白單克隆抗體用0.02 mol磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=8.0）進行透析，4℃過夜，然后收集抗體，測OD280吸光度值，計算抗體的濃度；將水溶性的Biotin用純化水稀釋至1 mg/ml；將S100B蛋白抗體與Biotin按照質量10∶1的比例進行混合，混勻后4℃反應30 min；將偶聯后的抗體用0.02 mol PBS（pH=7.4）透析過夜，每2 h換液1次，透析3次；收集偶聯物，測OD280吸光度值，計算偶聯后的濃度；將交聯后的復合物Biotin-S100B蛋白單克隆抗體用R1稀釋液配制成5 μg/ml。

R2[辣根過氧化物酶（HRP）-S100B 蛋白抗體]試劑的制備：稱取5 mg HRP溶解于1 ml蒸餾水中，再加入0.2 ml新配的0.1 mol NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20 min；將上述溶液裝入透析袋中，用1 mmol pH 4.4的醋酸鈉緩沖液進行透析，4℃過夜；加20 μl 0.2 mol pH 9.5的碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5 mg S100B蛋白抗體在1 ml 0.01 mol碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2 h；加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液后混勻，4℃下靜置2 h；將上述液體裝入透析袋中，用0.15 mol pH 7.4的PBS進行透析，4℃過夜；進行收集，測定偶聯復合物的蛋白濃度；用R2稀釋液將HRP-S100B蛋白抗體復合物配制成0.5 μg/ml。

R0試劑的制備：鏈霉親和素與粒徑1 μm的羧基磁珠通過碳二亞胺（EDC）交聯劑，按照10 mg磁珠交聯0.3 mg鏈霉親和素的比例，交聯后用R0稀釋液將交聯后的磁珠稀釋至0.5 mg/ml。

校準品的制備：用校準品稀釋液稀釋S100B蛋白抗原，制備校準品。

1.2 儀器

1.2.1 原理

化學發光免疫分析儀包含免疫反應系統和化學發光分析系統2個部分。免疫反應系統是將發光物質（在反應劑激發下生成激發態中間體）直接標記在抗原或抗體上。化學發光分析系統在臨床檢驗和醫學實驗室有廣泛的應用[11]，利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成激發態中間體,當這種激發態中間體回到穩定的基態時發射出光子，采用光電倍增管，由單光子計數器檢測并傳輸至放大器，并加高壓電流放大，放大器將模擬電流轉化為數字電流，數字電流將發光信號由數據線傳輸給計算機，根據標準品建立的數學模型對樣品中的待測物濃度進行定量分析,經過軟件處理轉換成待測物濃度。不使用任何光源，避免了背景光和雜散光的干擾，降低了噪聲，提高了信噪比，可測定納克級或皮克級化學成分。同時開發設備的管理與控制軟件，采用Windows界面風格，與實驗室信息系統（laboratory information system，LIS）進行交換和共享數據。

1.2.2 構造

檢測儀器主要由試劑模塊、反應模塊、清洗模塊、檢測模塊4個部分組成，具體由試劑盤、樣本盤、磁微粒盤、裝載臺、反應盤、清洗盤和檢測盤構成，如圖2~4所示。

圖2 S100B蛋白檢測儀器實物圖

試劑模塊包括試劑盤、樣本盤和磁微粒盤。試劑盤用于存放試劑，提供2~8℃冷藏環境，具有試劑掃描定位功能；可以實現 360°旋轉，能同時容納30組試劑位；由步進電動機驅動，傳動結構為同步帶傳動，精度高、成本低；可以靈活取下，方便試劑保存。樣本盤用于存放待測樣本，可以自動檢測標本中的凝塊并探測液面高度；最多支持6個樣本架，均可作為急診樣本架，每個樣本架可裝載10個樣本，支持原采血管上機；能夠實現360°旋轉，由步進電動機驅動，傳動結構為齒輪傳動，精度高、壽命長；樣本針和試劑針雙針一體，位于樣本盤和試劑盤中間，分別用于吸取樣本和試劑。磁微粒盤用于存放磁微粒，儀器運行時，自動混勻磁微粒，其中外圈有8個小磁珠位（12 ml），內圈有1個大磁珠位（120 ml）；結構緊湊，采用行星齒輪結構，實現8組磁微粒在機混勻，同時參與試劑匹配，中間大容量磁微粒可以滿足多種試劑需要。

圖3 S100B蛋白檢測儀器各部件示意圖

圖4 S100B蛋白檢測儀器結構原理圖

反應模塊包括裝載臺、反應盤。裝載臺內置反應管，樣本、試劑和磁微粒在此處混合，共有2個反應杯盒，每個反應杯盒裝載96個反應管；具備位置記憶、夾管探測及自動跳轉功能，包括X軸移動機構、Y軸移動機構和抓手三大部分。反應盤用于抗原、抗體和磁珠的孵育，共有90個反應位，具有氣浴恒溫結構[（37±0.5）℃]、被動旋轉混勻結構；由步進電動機驅動，利用同步帶結構實現精準定位；同時在線容納90個孵育位，37℃精確控溫，實現全天在機穩定性8%以內。

清洗模塊由清洗盤構成。將含有磁微粒子的試劑和待測物形成的復合物從液體中分離出來，依靠永磁鐵吸附磁珠，避免磁珠的損耗；清洗時自動抖動旋轉，保證充分清洗；末端裝載有底物注液針，方便將底物加入清洗盤。清洗盤由轉盤、進液吐液結構、磁鐵3個部分組成，轉盤負責傳動反應杯，進吐液結構負責抽取廢液和吐出洗液，磁鐵部分負責收放磁微粒。

檢測模塊由檢測盤構成，用于標本的檢測，具有密閉的溫控結構設計，可以實現恒溫檢測；具有獨特的回形避光結構，同時采用知名品牌檢測單元，檢測數據精準。

1.2.3 主要技術指標

（1）反應區溫度控制的準確性和波動度：反應區溫度控制在（37±0.5）℃范圍內，波動度不超過1.0℃。（2）穩定性：開機處于穩定工作狀態后，第4小時、第8小時的測試結果與處于穩定工作狀態初始時的測試結果的相對偏倚不超過±10%。批內測量重復性[變異系數（coefficientofvariation，CV）]≤8%。（3）線性相關性：在不小于2個數量級的濃度范圍內，線性相關系數r≥0.95。（4）攜帶污染率：≤10-5。（5）工作條件：電源（220±22）V，（50±1）Hz；功率 1 500 W；環境溫度10～30℃；相對濕度≤80%；大氣壓力85.0～106.0 kPa。

1.2.4 檢測流程

該儀器檢測血清S100B蛋白的流程（如圖5所示）如下：（1）在裝載臺的反應管中加入樣本，加樣步驟為：R1試劑50μl+樣本或校準品25μl+R2試劑50μl，在37℃條件下反應10min；加入R0試劑50 μl，在37℃條件下反應5min。孵育過程在反應盤中進行。（2）孵育成功后，在清洗盤中利用磁分離技術反復清洗3次，將磁微粒-S100B蛋白復合物與液體環境分開，達到徹底清洗的目的。（3）加入發光底物液A、B各100 μl，產生光子，通過單光子計數器進行檢測，30s后讀取發光值，計算S100B蛋白的含量。

圖5 檢測流程圖

2 結果

2.1 試劑

基于納米磁微粒化學發光技術研制了檢測血清S100B蛋白的試劑。該試劑具有以下幾個特點：（1）利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發光面積，提高反應靈敏度；采用旋轉磁場使磁微粒-S100B蛋白復合物與雜質分離，具有分離速度快、效率高、可重復性好的特點。（2）使用單克隆抗體，提高反應的特異性。引入的生物素-親和素系統具有多級信號放大作用，不增加非特異性干擾，具有特異性好、穩定性高、實用性強、實驗成本低的優點。（3）在液相反應中，使用發光增強劑，將水分子從發光底物的發光位點排開，減少干擾，同時還可縮短發光的達峰時間，提高檢測速度。（4）該檢測方法所需標本量少，磁微粒綠色環保，無放射性污染。

2.2 磁微粒全自動化學發光免疫分析儀器

設計并制造了磁微粒全自動化學發光免疫分析儀器，該儀器有自動稀釋、準確加樣、恒溫反應等功能，可滿足隨機、批量、急診檢測模式；具有反應盤被動混勻結構，利于抗原、抗體和磁珠的孵育；具有清洗位旋轉震蕩清洗功能，使清洗更徹底，檢測結果更準確；具有樣本針、試劑針雙針設計，凝塊和液面自動探測，試劑恒溫冷藏等多種功能；設備的管理與控制軟件穩定性強、操作簡單、擴充性強，符合實驗室的業務工作流程需要。

2.3 臨床實驗

選取2017年12月至2018年2月某醫院16例顱腦創傷住院患者，入院即刻采集患者靜脈血4 ml，3 000 r/min離心10 min，獲得血清樣本，每例樣本分為2份，分別采用本文研究的試劑和檢測儀器（方法一）、羅氏S100B蛋白檢測試劑和Elecsys2010設備（方法二）進行測試，結果見表1。使用Pearson相關系數分析2種檢測方法的相關性（如圖6所示），r值為 0.959，P＜0.01，2種測試方法相關性好。

表1 2種方法檢測S100B蛋白結果ng/ml

圖6 2種檢測方法檢測S100B蛋白的相關性

3 結語

S100B蛋白對顱腦創傷的診斷有重要參考價值，可以優化該類患者的檢查流程，減少輕型顱腦創傷患者接受輻射的劑量，節約醫療資源，降低醫療費用。在瑞典，S100B蛋白被納入顱腦創傷指南：低風險輕型顱腦創傷患者受傷6 h內，如血清S100B蛋白＜0.1 ng/ml，可先進行臨床觀察[8]。美國急診醫師學會的指南亦推薦，創傷后4 h內血清S100B蛋白＞0.1 ng/ml為頭顱CT檢查的最佳適應證[12]。國內研究也表明，血清S100B蛋白含量越高，顱腦創傷越嚴重，預后越差，血清S100B蛋白測定可作為判斷顱腦創傷嚴重程度及預后的重要指標，具有重要的臨床應用價值[13]。基于納米磁微粒化學發光免疫分析技術的S100B蛋白檢測方法具有靈敏度高、特異性強、線性范圍寬、簡單快速、可重復性好、安全無毒等優點；檢測儀器穩定可靠，可以提供樣本的快速、批量檢測，自動化程度高。盡管該檢測目前尚未被廣泛應用于臨床工作中，但相信該檢測試劑及儀器的國產化，可以為臨床診斷和科研工作提供可靠的檢測方法。