抗拿撲凈除草劑谷子快速鑒定方法分析

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(1.山西省農業科學院作物科學研究所，農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，太原 030031；2.山西省農業科學院農作物品種資源研究所，太原 030031)

谷子是傳統的糧、飼、草兼用作物，也是我國北方重要的糧食作物。谷子生產中，間苗是一項極其繁重的勞動，不但費工費時，而且勞動效率低下，難于進行集約化規模種植，嚴重制約著谷子的大面積生產，簡化栽培谷子品種的選育成為目前的主要育種目標之一[1-3]。河北省農林科學院1993 年從國外引進了谷子抗除草劑基因，并將其成功導入到栽培種中，谷子的抗除草劑育種由此開始[4]，2003年河北省農林科學院谷子研究所提出了“簡化栽培谷子品種選育及其配套栽培方法”，提出在培育抗、感拿撲凈同型姊妹系的過程中，苗期通過噴施拿撲凈同步實現化學間苗、化學除草，這一理論思想為谷子育種開拓了新的思路[5]。

谷子抗拿撲凈除草劑類型遺傳基礎簡單，同時具有抗性強等優點，缺點是拿撲凈對雙子葉雜草無效，田間除草不徹底，但可以配套使用“谷友”防治雙子葉雜草，從而達到徹底除草的目的。自抗“拿撲凈”谷子栽培種成功獲得后，抗“拿撲凈”除草劑材料在全國范圍內引入研究，為谷子抗除草劑新品種的選育，解決谷田雜草提供了理論依據和技術保障。如何快速準確地鑒定谷子的拿撲凈抗性，并將其抗性應用到谷子雜交及系譜選育過程中，具有重要的現實意義。

谷子中抗“拿撲凈”基因Srf來源于谷子的一個近緣物種青狗尾草的突變株，其抗性由細胞核顯性單核基因控制[6-7]。F1代便可以進行真雜種鑒定，解決了在沒有指示性狀，谷子由于顆粒小，去雄困難，鑒定真雜種難的問題。植物除草劑抗性鑒定的方法主要有整株植物測定法、組織或器官的形態結構比較鑒定法、生理生化鑒定法、DNA分子水平鑒定法等[8-10]。整株植物測定法和形態結構鑒定法簡單、重復性好，適用于植物的大批量鑒定或田間進行抗性植株的篩選，但鑒定結果不太準確，且工作量大；生理生化和分子檢測法方法比較快捷，但較難掌握，試驗條件要求嚴格[8-10]。因此，育種工作者和種子相關企業常采用培養皿法進行種子抗性的快速鑒定。傳統的培養皿鑒定技術一般是在種子出芽后噴施除草劑，反應慢，周期長，在此過程中，如果加水不及時或出現低溫等情況，容易造成芽死亡，最終影響判斷結果。張婷等[9]采用的是將種子置于濾紙上即噴藥處理，該方法簡便快捷，但在藥劑量上把握不夠準確。因此，本研究以抗除草劑品種、后代材料及常規品種進行濃度和時間梯度試驗，旨在選擇一種更快更準確的方法進行鑒定，從而為谷子育種提供理論支撐和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為河北省農林科學院谷子研究所選育的冀谷41號、冀谷36號及山西省農業科學院作物科學研究所選育的后代材料K 1043及常規谷子新品種晉谷36號，測試除草劑為拿撲凈。

1.2 試驗方法

為了獲取最佳的拿撲凈除草劑處理劑量及浸泡時間，設置0.1%、0.2%、0.4%、0.6% 4個不同的濃度梯度；浸泡時間設置10，20，30，40，50，60 min 6個梯度。

每份樣品選取100粒健康飽滿的種子，按照試驗要求浸泡完成后將種子晾干進行培養皿發芽，2次重復；培養皿內放置約0.5 cm厚的海綿，加水至海綿吸足后，濾去多余的水分，發芽時間4～5 d；記錄種子發芽粒數，定義為“出芽數”，種子發芽后，由于部分種子沒有抗性，出芽的幼苗后期失去活力，最終枯萎。死亡的種子粒數，定義為“死苗數”，后期正常生長的種子粒數，定義為“存活數”。

發芽培養箱采用DHP-90508智能型電熱恒溫培養箱，設定27 ℃恒溫。

1.3 統計方法

采用Excel 2007 軟件處理原始數據，SPSS 16.0軟件進行繪圖與統計分析。

2 結果與分析

2.1 拿撲凈浸泡液濃度對種子抗性的影響

應用冀谷41號進行試驗，在相同浸泡時間下，隨著拿撲凈浸泡液濃度的提高，種子發芽并正常生長即種子的存活率逐漸降低，不同的浸泡時間，種子的存活率降幅為0.5%～15.5%(表1)，最低降幅發生在浸泡時間10 min，浸泡液濃度由b=0.2%提高至c=0.4%，最高降幅發生在浸泡達50 min，濃度由c=0.4%提高至d=0.6%。

在相同拿撲凈浸泡液濃度下，前3個時間梯度(10，20，30 min)下種子的存活率持續降低，當浸泡濃度為d=0.6%時，此時間梯度內，種子存活率由81.5%降低至70.0%，延長濃度c和濃度d的浸泡時間，發現浸泡時間延長后，種子存活率開始提高，并沒有持續下降，其中原因有待進一步試驗驗證。

表1 不同濃度梯度不同浸泡時間下冀谷41號存活率

注：濃度梯度a=0.1%，b=0.2%，c=0.4%，d=0.6%；ck表示種子沒有浸泡時間；梯度1=10 min，2=20 min，3=30 min，4=40 min，5=50 min，6=60 min。下同。

2.2 不同品種對拿撲凈浸泡液反應差異

在品種進行田間抗性選擇或純化的過程中，隨著田間拿撲凈選擇的壓力，品種的抗性水平有些增強，有些降低。由表2和圖1可以看出，2個抗性品種在拿撲凈除草劑的浸泡下，種子存活率較對照均有下降，同一品種在不同拿撲凈濃度浸泡下，種子存活率的下降水平有差異，濃度越高，下降程度越大，冀谷36號在濃度c和濃度d浸泡下，與對照相比，種子存活率下降百分比分別為11.33%和17.17%；冀谷41分別為9.50%和14.75%。

表2 不同品種不同藥液濃度浸泡時間的發芽率

圖1 冀谷36號和冀谷41號浸泡前后的發芽率差

2.3 育種后代材料的鑒定分離

從后代抗性分離規律中(表3)，發現隨著拿撲凈濃度的提高和浸泡時間的延長，種子死苗數的比例逐漸提升，同樣當浸泡時間超過30 min后，種子的存活數開始有所提升，然后隨著浸泡時間的延長，開始下降。抗性與非抗性材料的比例在所有處理中均未符合3∶1的分離比例，且隨著拿撲凈濃度的提高，種子的存活數下降很大，在同樣浸泡10 min的處理下，0.6%濃度較0.4%濃度種子的存活率下降高達30.0%，這表明后代材料對拿撲凈藥液的敏感程度很強。

對常規谷子新品種晉谷36號進行同樣濃度和梯度的試驗，結果顯示，在最低濃度0.1%且浸泡最短時間10 min處理下，種子存活率仍然為零，這表明對于不抗除草劑的谷子品種對拿撲凈藥液的敏感程度更強。因此建議對后代材料進行抗性判斷時，應用低濃度浸泡10 min即可。

表3 后代材料K 1043抗性分離規律

3 結論與討論

通過對抗拿撲凈谷子新品種冀谷36號、冀谷41號及K 1043進行不同濃度和不同時間梯度的試驗，發現同一浸泡時間下，隨著拿撲凈濃度的提高，種子的存活率有所下降；同一浸泡濃度下，隨著浸泡時間的延長，種子的存活率逐漸下降，且拿撲凈浸泡30 min是一個時間拐點，因種子的發芽率受諸多因素影響，其中原因有待進一步分析。隨著田間藥劑的噴施選擇，有些抗性增強，有些降低，后代材料表現最敏感，本研究中不同谷子品種表現的敏感程度不一致。培養皿試驗排除了大田的誤差，驗證了不同材料對除草劑濃度的敏感程度不同。

谷子中抗“拿撲凈”基因是由一對顯性單核基因控制[6-7]，F1代抗感分離比例理論值為3∶1，但種子的發芽率受很多因素影響，種子的發芽性能還取決于種子本身的遺傳特性及種子的形態結構和生理活性等[11-12]，因此應用培養皿進行后代分離鑒定不一定符合抗感分離比例，但仍可以作為快速鑒定方法進行應用，且后代材料和常規谷子品種對拿撲凈敏感，本研究建議采用低濃度浸泡10 min即可進行抗性判斷。這種方法較大田種植進行苗期鑒定省時、省力，且不受季節限制，可以縮短育種周期，提高育種效率。