不同激素對白及種子無菌萌發生長的影響

， ， ，

(武昌理工學院生命科學學院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430223)

白及(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)為蘭科白及屬多年生草本植物，其塊莖是我國傳統中藥，具有收斂止血、消腫生肌的功效，近年來還被發現具有抗腫瘤作用，市場對白及的需求量十分旺盛。白及種子眾多，一個蒴果內含數萬粒種子，但是種子不含胚乳，需要共生菌共生萌發，在自然條件下很難萌發和生長，分株繁殖難以滿足規模栽培的需要。應用組織培養技術建立白及種子的高效萌發和增殖體系可以實現白及種子的資源利用、白及種苗的快速繁殖和種質資源的保存。

目前白及的組織培養有較多報道，假鱗莖[1]、幼根、莖尖、葉片[2]、蒴果[3-10]都是常用的外植體，其中葉片的培養尚無報道，種子的培養效果較好。在種子萌發的研究中，應用最多的激素是6-BA 和NAA，KT、2，4-D、GA3也有少量應用。激素使用的濃度區間集中為0～3.0 mg/L，激素對種子萌發的作用結論各異。張燕等研究表明，1.0 mg/L NAA適合種子萌發，0.1 mg/L 6-BA和NAA組合會降低種子萌發率[8]。趙漫麗等研究表明，2.0 mg/L以下濃度的6-BA和1.0 mg/L NAA組合促進種子萌發[5]。王楷等研究表明,1.0 mg/L 6-BA適合白及種子萌發[4]。赤霉素作用報道很少,激素對白及種子的萌發作用缺乏系統研究。本實驗采用三因素三水平正交實驗，篩選適合白及種子萌發的激素條件，研究激素對白及種子萌發的作用。

1 材料、儀器與試劑

白及蒴果購于湖北省京山縣湖北聚通白及種植合作社基地，經武昌理工學院張國彬教師鑒定為白及蒴果。種子為紫花三叉白及品種，胚齡20～21周[3]。

SW-CJ-2 FD 潔凈工作臺、SPX-250 B-G 光照培養箱、YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；6-BA、NAA、GA3購于美國sigma公司，其他試劑為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 白及種子的接種培養

以1/2 MS為基本培養基，按表1添加不同濃度的6-BA 、NAA、GA3形成9種不同的種子萌發培養基，同時配制0.2% 稀瓊脂溶液用于種子的涂布。將白及蒴果消毒后取出種子，加入到稀瓊脂中分散成種子懸液，轉移到培養基上用涂布棒涂布均勻[7]，每種培養基接種4個培養皿，共36個樣品，轉入光照培養箱培養。在實驗完成后1周內重復本實驗2次。

表1 白及種子萌發培養基

2.2 不同培養基上白及種子的萌發生長情況

從接種次日起，每天觀察種子的萌發情況，記錄種子的形態變化，重點記錄各培養基上種子的初萌時間、萌發率、幼苗大小和生長狀態，1周進行1次統計分析。其中初萌時間以培養基上10%的種子萌發為標準，30 d后統計種子萌發結果。在不含激素的1號培養基上，3 d后白及種子體積增大(圖1)，1周后種子顯著轉綠，10 d時種胚形成直徑1～2 mm的原球莖，部分原球莖可突破種皮(圖2)，2周左右可見芽點，種子萌發。添加有植物激素的培養基中，種胚轉綠、萌發時間提前，例如3號培養基中2周時原球莖體積約為1號中的4倍，可見長出的幼葉(圖3)。GA3對種子萌發方式影響顯著，不含赤霉素的培養基中，種子主要以原球莖方式萌發，含赤霉素的培養基中種子多數以直接方式萌發，表現為葉軸伸長，基部顏色變淺(圖4)。30 d后所有培養基上的種子都已經萌發(圖5)，各培養基中的萌發效果不同(表2)，高濃度即1.0 mg/L的赤霉素易導致白及幼苗玻璃化(圖6)，0.5 mg/L的赤霉素與高濃度即1.0 mg/L的NAA組合也會導致幼苗生長后期發生玻璃化。

圖1 接種4 d的白及種子

圖2 10 d 1號培養基上種子萌發

圖3 2周3號培養基上種子萌發

圖4 2周5號培養基上種子萌發

圖5 30 d 1號培養基上種子萌發

圖6 30 d 9號培養基上種子萌發

從表2可以看出，激素對白及種子萌發有重要影響，添加1.0 mg/L以下濃度的外源6-BA和NAA可以提高種子發芽率，促進種子提早萌發。赤霉素影響種子的發芽方式，促進種子早萌，同時會引起種苗發生嚴重的玻璃化，6-BA可起拮抗作用降低赤霉素引起的玻璃化效應，NAA組合可加重玻璃化效應。由于沒有進行赤霉素誘導萌發后轉移種子至無赤霉素培養基上的繼代培養實驗，無法確定種子萌發后去掉赤霉素種子是否會發生玻璃化，推測該措施有一定的抑制玻璃化的作用。赤霉素和NAA組合可以促進種子細胞的分裂，使種子體積增大，萌發速度加快，葉片生長迅速，但會導致嚴重的玻璃化現象。

表2 白及種子萌發結果

2.3 白及幼苗的增殖培養

35 d后，將萌發生長良好的白及幼苗轉接到MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養基中進行增殖培養，觀察幼苗增殖情況。在無赤霉素培養基上萌發的幼苗繼代后生長良好，芽苗健壯(圖7)，后期形成健壯的不定根，適宜移栽(圖10)。在含有0.5 mg/L赤霉素的培養基上萌發的幼苗基部容易褐化(圖8、圖9)，一部分幼苗不易生根。在1.0 mg/L赤霉素培養基上萌發的幼苗基部褐化嚴重，80%后期死亡。

圖7 1號培養基種子繼代培養

圖8 4號培養基種子繼代培養

圖9 5號培養基種子繼代培養

圖10 繼代3周后的白及幼苗

3 討 論

在白及種子無菌萌發實驗中，6-BA和NAA應用較多、觀點不一，赤霉素應用較少，本實驗應用GA3、

6-BA和NAA的不同組合來研究植物激素對白及種子萌發的作用，結果顯示1.0 mg/L以下濃度的6-BA和NAA組合可以提高種子的發芽率，GA3在種子萌發早期可以促進種子萌發、影響種子發育方式，但在后期會導致種苗的玻璃化并引起褐化。現有研究中關于白及種子萌發過程的報道較多，玻璃化和褐化少見報道。張燕等的研究表明，白及種子可能以兩種方式中的一種萌發，即原球莖途徑和根狀莖途徑[6]。本實驗中，不含赤霉素的培養基上白及種子以原球莖途徑萌發，含赤霉素的培養基中種子萌發時先膨大呈原球莖結構，然后葉迅速伸長，表現為幼葉直接伸長生長，沒有出現典型的根狀莖，推測是赤霉素顯著促進了葉原基和葉基細胞的分裂和生長。由于6-BA可拮抗赤霉素引起的玻璃化效應，NAA可加重玻璃化效應，推測3種激素之間存在互作，鑒于玻璃化現象沒有以萌發率作為有效指標進行方差分析。

6-BA和NAA組合實驗中，由于沒有對應的單因素實驗，無法判斷激素組合和單一激素的效果哪個更好，這是本實驗后續需要完善的地方。添加赤霉素的培養基，在白及種子開始萌發2周時促進萌發，5周后出現嚴重的玻璃化和后續培養不同程度的褐化，可能原因是實驗中使用的GA3濃度較高，在種子萌發初期進行繼代、設計濃度較低于0.5 mg/L的赤霉素培養基培養種子是后續可考慮的方案。