重金屬脅迫對白三葉種子萌發的影響

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(1.貴州師范大學生命科學學院，貴陽 550001； 2.貴州省草原監理站，貴陽 550001)

重金屬是危害較大且來源廣泛的土壤污染物[1]，主要指生物毒性顯著的汞(Hg)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr) 以及類金屬砷 (As)，還包括具有毒性的重金屬鋅 (Zn)、銅 (Cu)、鈷 (Co)、鎳 (Ni)、錫 (Sn)。隨著經濟的迅速發展，重金屬污染已成為危害生態最重要的環境問題之一。工業污水的排放量和農業化肥使用量逐年增多，重金屬離子嚴重污染水體，并在土壤中大量累積，破壞土壤生態系統[2]。同時，在植物中累積，降低種子的發芽率和脂肪含量，降低植物體內一些酶的活性和葉綠素含量，抑制植物光合作用和生長發育等，嚴重影響植物發育，進而影響動物和人類的健康[3]。

草坪草能夠吸收污染物[4-5]，對重金屬污染的土壤也有很好的修復效果[6]。白三葉(Trifoliumrepens)屬豆科(Leguminosae)，三葉草屬多年生草本植物，又名白車軸草和白花苜蓿等，多被應用于草坪植物綠化。已有文獻報道白三葉對重金屬Cd脅迫有良好的耐受性[7]，同時對重金屬Zn有一定的耐受性和適應性，在重金屬Zn污染土壤的植物修復中有著一定的潛在應用前景[8]。此外，韋新東等研究表明，白三葉可以在低濃度的Cd和Pb污染的環境下萌發，生長[9]。在白三葉重金屬脅迫方面的研究相對較多，但不夠完善和集中。

為研究重金屬離子對白三葉的毒害情況，本實驗模擬4種不同濃度重金屬離子(Zn2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+)對白三葉種子進行脅迫處理，測定種子發芽率、發芽勢、發芽指數和相對胚根(芽)長等相關指標。探討不同重金屬離子脅迫對白三葉種子萌發的影響，了解白三葉種子對四種重金屬離子的耐受性關系，為白三葉作為不同重金屬環境下的綠化植被提供理論依據，發掘白三葉在重金屬污染修復潛力。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗材料：白三葉(海發，購自于貴陽種子公司)；

供試試劑：Pb(NO3)2、CdCl2、CuSO4·5 H2O、KMnO4、ZnSO4·7 H2O、Hoagland營養液。

1.2 試驗方法

試驗于2017年6月在貴州師范大學生命科學學院實驗室內進行。重金屬Zn2+、Pb2+、Cu2+和Cd2+分別以溶液的形式加入培養皿中，根據中華人民共和國國家土壤環境質量標準(GB 15618-1995)3級土壤環境標準量進行重金屬離子濃度梯度的配制，濃度梯度分別為Zn2+200，500，800，1 100，1 400 mg/L；Pb2+500，1 000，1 500，2 000，2 500 mg/L；Cu2+100，200，300，400，500 mg/L；Cd2+1，50，100，150，200 mg/L[10]，同時設置對照組。

將用于實驗的種子進行篩選，棄去干癟和殘缺不全的種子，用濃度為0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡待試種子15 min，然后用蒸餾水沖洗直至紅色完全消失，用濾紙將種子表面的水分吸干。實驗采用鋪有2層濾紙的直徑為90 mm的潔凈培養皿為發芽床，每個培養皿均勻放入50粒種子，并加入10 mL用Hoagland營養液配制好的重金屬溶液，空白對照組則直接加入等體積的Hoagland營養液。每處理重復3次。蓋上皿蓋并置于陰涼通風處，利用自然光源對其進行光照處理，逐日觀察并記錄發芽的種子數(以胚芽長度達到種子一半為判斷種子發芽的標準[11])。記錄10 d內白三葉種子的發芽數，并在培養結束后每皿隨機挑選5顆幼苗，用鑷子將萌發的幼苗取出，濾紙吸干表面水分后分別測量其胚根長和胚芽長并記錄。

1.3 數據處理

所有數據使用SPSS 22.0統計軟件，采用單因素LSD法對不同處理條件下的白三葉的發芽率、發芽勢、發芽指數、胚根長和胚芽長等各項數據進行分析。采用Excel 2010軟件進行統計并制圖。

1.4 相關數據計算公式

發芽率(%)=(發芽種子數/供試種子總數)×100%；

發芽勢(%)=[發芽初期(前3 d)正常發芽種子數/供試種子總數]×100%；

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt為處理t日的發芽數，Dt為相應的發芽天數；

相對胚根(芽)長=[處理草種胚根(芽)長/對照胚根(芽)長]×100%。

2 結果與分析

2.1 重金屬Zn對白三葉種子萌發的影響

從表1可看出，在不同Zn2+濃度的處理下，種子的發芽率隨著Zn2+濃度升高呈下降趨勢，加入Zn2+的種子發芽率顯著低于對照組。對照組種子的發芽率最高達到77.33%，在Zn2+濃度為500 mg/L時，種子的發芽率出現了小幅度的升高，當Zn2+的濃度大于500 mg/L時，與對照組相比發芽率顯著抑制，Zn2+濃度達到1 400 mg/L時，種子的發芽率最低，為46.67%。

重金屬Zn對種子發芽勢有抑制作用，在Zn2+脅迫下，隨著濃度升高種子的發芽勢呈下降的趨勢，濃度在800～1 400 mg/L時發芽勢顯著低于0～800 mg/L時。對照組發芽勢最高,為56.67%，當Zn2+濃度在1 100 mg/L時，種子的發芽勢達到最低值,為15.33%。

重金屬Zn對種子發芽指數同樣有抑制作用，種子的發芽指數隨著Zn2+濃度的升高呈下降趨勢，與對照組相比高濃度顯著抑制種子發芽指數，當濃度高于800 mg/L時，抑制作用趨于平穩。對照組種子的發芽指數達到最高，為19.11，當濃度超過800 mg/L時，種子發芽指數變化不顯著，Zn2+濃度為1 100 mg/L時，種子的發芽指數最低，為6.11。

表1 不同濃度Zn2+處理對種子萌發的影響

注：同列不同字母間表示差異顯著(p<0.05)。下同。

2.2 重金屬Pb脅迫對白三葉種子萌發的影響

由表2可知，重金屬Pb脅迫下，白三葉種子的發芽率總體呈下降趨勢。對照組發芽率最高，為 71.33%，當Pb2+濃度達到1 000 mg/L時發芽率有升高趨勢，Pb2+濃度超過1 000 mg/L后整體顯著下降，在Pb2+濃度為2 500 mg/L時出現最低值，此時發芽率為 3.33%。

表2 不同濃度Pb2+處理對種子萌發的影響

種子的發芽勢呈下降趨勢，發芽勢顯著性與發芽率基本一致。對照組發芽勢最高，為56.67%，當濃度超過1 000 mg/L后呈現下降趨勢，濃度高于1 000 mg/L的發芽勢顯著低于對照組，且在Pb2+濃度為2 500 mg/L時發芽勢降至最低，為1.33%。

發芽指數呈現先升高后降低的趨勢，發芽勢顯著性同發芽率顯著性一致。對照組發芽指數最大值為16.91，在Pb2+濃度為1 000 mg/L時發芽指數有所上升，超過此濃度呈現顯著下降趨勢，且Pb2+濃度為2 500 mg/L時發芽指數僅為0.5。

2.3 重金屬Cu脅迫對白三葉種子萌發的影響

由表3可知，重金屬Cu脅迫下，種子發芽率隨著Cu2+濃度的增加而降低，濃度低于300 mg/L時發芽率變化不顯著，濃度高于300 mg/L呈顯著下降趨勢，當濃度升高至500 mg/L時發芽率最低，為38%。

Cu2+對白三葉發芽勢的影響表現為下降趨勢，濃度小于400 mg/L時種子發芽勢變化不顯著，當濃度達到500 mg/L時與對照組相比發芽勢顯著抑制，此時的發芽勢為37.33%。

低濃度Cu2+對種子發芽指數的影響較弱，高濃度使得發芽指數降低。濃度小于200 mg/L時發指數變化不顯著，當濃度高于300 mg/L時與對照組相比表現為顯著抑制，濃度達500 mg/L時發芽指數最低，為8.96。

表3 不同濃度Cu2+處理對種子萌發的影響

2.4 重金屬Cd脅迫對白三葉種子萌發的影響

表4表明，不同濃度Cd2+脅迫下，種子發芽率隨著Cd2+濃度的增加呈先上升后下降趨勢，種子在1 mg/L的低濃度處理下表現為促進作用，發芽率最高，為77.33%，超過此濃度發芽率被抑制，濃度越高抑制越明顯，直到濃度為200 mg/L時發芽率達最低，為50%。

表4 不同濃度Cd2+處理對種子萌發的影響

Cd2+對種子發芽勢和發芽指數的影響表現為抑制，從數據來看，發芽勢和發芽指數的趨勢與發芽率相同，低濃度抑制作用較小、高濃度顯著抑制。

2.5 4種重金屬離子處理對種子相對胚根(芽)長的影響

如圖1所示，4種重金屬離子脅迫下白三葉的相對胚根長明顯低于相對胚芽長，表明重金屬離子對胚根的影響大于胚芽。低濃度的Zn2+溶液處理對胚根生長有一定的促進作用，Zn2+濃度在200 mg/L時種子的相對胚根長顯著高于對照組，隨著重金屬溶液濃度的升高，種子的相對胚根長呈逐漸下降趨勢，表現為抑制作用，當濃度超過800 mg/L時，Zn2+對胚根的影響趨于穩定；隨著Zn2+濃度增加相對胚芽長顯著下降，200 mg/L的低濃度處理，胚芽長與對照組相比差異極小，當濃度高于200 mg/L時下降趨勢明顯。

圖1 不同濃度4種重金屬離子處理對種子相對胚根(芽)長的影響

低濃度的Pb2+溶液處理對胚根(芽)生長均有一定的促進作用，Pb2+濃度在500 mg/L時相對胚根(芽)長均高于對照組，隨著濃度升高相對胚根長顯著下降接近于零，濃度較高時種子將致死不生長。

Cu2+處理下，種子的相對胚根長隨濃度的升高呈下降趨勢，低濃度的Cu2+處理對種子的胚芽生長有一定促進作用，對胚根長影響不大，濃度為100 mg/L時，相對胚芽長顯著高于對照組，相對胚芽長與對照組差異不顯著，當濃度高于100 mg/L時，相對胚根(芽)長均顯著低于對照組。

Cd2+處理下，種子的相對胚根(芽)長均隨濃度升高而下降，高濃度顯著抑制胚根(芽)的生長，濃度在100，150，200 mg/L時的相對胚根(芽)長變化不明顯。

3 討 論

種子的萌發和生長是植物接觸外界一切反應的開端，也是其對外界刺激最為敏感的階段[12]。種子萌發時期的發芽率、發芽勢、發芽指數是判斷種子發芽能力的重要指標，能夠直觀地反映種子的發芽速率和生長的趨勢，而它的生長狀況(如幼苗的相對胚根胚芽長)則直接與幼苗的生長及生物量相聯系[13]。通過觀察重金屬溶液處理后的種子萌發情況及胚根與胚芽的發育情況，是深入研究重金屬污染對植物影響的前提。

重金屬處理對白三葉種子的萌發具有抑制作用，4種重金屬低濃度處理，種子萌發情況與對照組相比變化較小，說明白三葉具有一定的抗低濃度重金屬能力，且低濃度的Cd2+可以加速種子萌發，已有學者證明白三葉具有較強的抗重金屬Cd的能力，與本實驗結果基本一致[14]。濃度越高對種子萌發的抑制效應越強，但超出一定濃度(如Zn2+：800 mg/L ，Cd2+：50 mg/L)之后，對發芽率、發芽勢和發芽指數的抑制效應有所消除，導致發芽率、發芽勢和發芽指數出現一個小幅度的上升期或平穩期[15]。高濃度重金屬Pb2+和Cu2+對種子萌發影響較大，由于植物活性氧代謝系統平衡受到影響，細胞膜遭到損傷，物質交換不能正常進行，導致植物的萌發和生長受到抑制，種子的萌發能力被打破[16]。

在不同濃度重金屬離子處理下種子相對胚根長小于相對胚芽長，表明重金屬脅迫首先影響白三葉根部的生長發育，從而抑制白三葉的生長。在種子的萌發時期，重金屬對白三葉生長發育的影響都主要體現在抑制白三葉的根生長，也符合已有的研究結果[17]。隨著濃度的升高胚根(芽)生長整體呈現顯著下降趨勢，與趙玉紅等的結果一致[18]。低濃度重金屬Zn2+和 Pb2+處理對種子的胚根(芽)生長有顯著的促進作用，Cu2+和Cd2+處理下種子的胚根(芽)生長變化不大，低濃度重金屬溶液處理對種子胚根(芽)生長影響較小。高濃度重金屬離子脅迫對種子萌發的影響其實是不可修復的，表明大部分的種子在該環境下已經不能正常生長或種子的某些生理結構已經被破壞。有研究表明，植物吸收過量的Zn2+會對植物的根系造成損害，阻礙根的生長，從而影響植物的生長發育[19]。

研究白三葉種子萌發對重金屬的響應，應從種子發芽率、發芽勢、發芽指數以及相對胚根(芽)長的等多方面入手。參照國家三級土壤標準重金屬濃度范圍，分析可知白三葉對Cd2+的耐受能力最強，Zn2+和Cu2+次之，對Pb2+的耐受能力最弱。在Cd2+不同濃度條件下種子的發芽率均大于50%，相對胚根(芽)長大于30%，且Cd2+濃度為1 mg/L時可促進種子的萌發。而Pb2+達到一定濃度(1 500 mg/L)后發芽率小于25%，濃度在2 500 mg/L時發芽率僅為3.33%，相對胚根(芽)小于10%。此結果與已報道的研究結論吻合，即白三葉較耐鎘，對鉛、銅、鋅耐性較差[20]。但與宋鳳鳴等試驗結果有一定差異，可能與品種以及重金屬用量不同有關[21]。有盆栽試驗研究認為，白三葉能同時富集中低度銅、鎘、鉛，對復合污染的土壤具有較好的修復作用[22]。雖然白三葉能夠富集重金屬的范圍有限，但是不應該只看重單一植物的修復效果，白三葉的高生物量和強大的適應性會成為它的優勢，從而得到更多更有效的應用，而這需要進行更深一步的研究。

4 結 論

綜上所述，4種不同濃度重金屬處理下，隨著濃度的升高，種子的萌發整體表現為抑制作用，白三葉對Cd2+的耐受能力最強，Zn2+和Cu2+次之，對Pb2+的耐受能力最弱；高濃度的重金屬濃度培養條件對白三葉種子萌發及生長發育會產生嚴重的阻礙作用，當Pb2+濃度在2 500 mg/L時發芽率僅為3.33%；低濃度重金屬Zn2+、Cu2+、Pb2+環境對胚生長具有一定促進作用；重金屬脅迫首先影響的是種子根部的生長發育，從而抑制白三葉的生長。對比4種重金屬污染條件，白三葉對鎘的耐受能力最強，在5種不同濃度的Cd2+條件下種子的發芽率均高于50%，且Cd2+濃度為1 mg/L時可促進種子的萌發，因此其作為Cd污染的土壤的修復植物有一定的前景。