常染色體隱性遺傳視網膜色素變性的相關基因研究進展

王 睿，金 明

0引言

視網膜色素變性(rentinitis pigmentosa，RP)是一種遺傳性視網膜疾病，在西方發病率為1/4000[1]，國內發病率為1/4016～1/3467[2]，全世界約有150萬以上患者，目前的治療方法有藥物治療、中醫治療、基因治療、干細胞移植和人工視網膜假體等。RP的發病機制為光感受器和色素上皮變性引起的視網膜病變，早期以視桿細胞受損為主，晚期視錐視桿細胞變性凋亡，導致視力持續下降并最終失明，是發達國家主要致盲眼病之一[3]。臨床表現為夜盲、進行性視野縮窄和視力下降。眼底表現為骨細胞樣色素沉著、視網膜血管變細、視盤蠟黃三聯癥[1]，可能伴有黃斑囊樣水腫，約39%～72%的患者伴有后囊下白內障、高度近視、散光、圓錐角膜和輕度聽力受損(不包括Usher綜合征患者)，XLRP女性攜帶者有50%在眼底后極部可見金色反光[4]。

按照是否合并除眼部表現以外的全身其他癥狀，可將RP分為非綜合征型(non-syndromic retinitis pigmentosa，NSRP)和綜合征型(syndromic retinitis pigmentosa，SRP)。SRP有30余種，Usher綜合征(又名遺傳學耳聾-視網膜色素變性，USH)和Bardet-Biedl綜合征(BBS)是較為常見的類型，分別占SRP的20%～40%[1]和5%～6%[5]。NSRP又可分為典型RP和非典型RP(如結晶樣RP、白點狀RP、無色素性RP、單眼RP等)[6]。目前已定位了70余個與NSRP相關的基因[4]，SRP的相關致病基因也可能導致NSRP。RP的遺傳方式約15%～25%為常染色體顯性遺傳(autosoma dominant rentinitis pigmentosa，ADRP)，5%～20%為常染色體隱性遺傳(autosomal recessive rentinitis pigmentosa，ARRP)，5%～15%為X染色體連鎖遺傳(X-linked rentinitis pigmentosa，XLRP)，還有40%～50%遺傳方式不明確，Y染色體連鎖遺傳(Y-linked rentinitis pigmentosa，YLRP)、雙基因遺傳(digenic RP)和線粒體遺傳(mitochondrial RP)也有散發報道[5]。ARRP目前已定位43個致病基因，克隆了其中40個，并且不斷有新的相關致病基因被報道[7]。既往關于常見RP相關基因的研究已有許多，現就自2015年以來新發現與RP相關的基因研究進行綜述。

1 AGBL5基因

1.1 AGBL5基因定位、克隆和表達AGBL5基因(AATP/GTP binding protein like 5)又名CCP5基因(cytosolic carboxy peptidases 5)，定位于染色體2p23.3上，長度約3199bp，包含18個外顯子。其編碼產物為886個氨基酸組成的AATP/GTP-結合類蛋白質5(又名細胞溶質羧肽酶樣蛋白5)，屬于胞質羧肽酶M14家族蛋白的成員[8]，參與蛋白質去谷氨酰化，是一種重要的微管蛋白修飾酶[9]。

Kastner等[10]發現人視網膜中AGBL5呈高表達，而在沒有視網膜的眼球中幾乎檢測不到，通過免疫組織化學法分析技術在人視網膜的所有結構層中均檢測到AGBL5，最顯著的是在視錐細胞內段、神經節細胞和神經纖維層上。Lyons等[11]制作了AGBL5基因抑制斑馬魚模型，發現斑馬魚出現腦積水并且眼睛尺寸減小，隨后注射AGBL5 mRNA可逆轉該現象，實驗表明AGBL5在纖毛的生長發育和功能發揮中扮演重要角色。胞質羧肽酶家族(cytosolic carboxy peptidases，CCPs)通過對微管蛋白的修飾來控制微管內的裝配、運輸和信號傳導，隨著真核生物的進化，這個機制從纖毛普及到細胞和軸突微管[12]。Berezniuk等[8]發現AGBL5的“雙功能”(dual-functional)修飾酶作用，它通過切割α-和β-微管蛋白側鏈，α-微管蛋白C末端的α-連接的谷氨酸殘基，改變微管(microtubules)的穩定性、修飾微管，并且調節微管與結合蛋白、分子馬達之間的相互作用。2016年，Aillaud等[13]研究再一次驗證了AGBL5催化αΔ3-微管蛋白形成的功能。在AGBL5對α-微管蛋白C-末端的影響方面，Berezniuk認為該酶能夠處理相關的谷氨酸殘基，將去酪氨酸微管蛋白轉化成αΔ2-微管蛋白，但Aillaud則認為AGBL5不能完成該過程。這兩項研究結果出現差異最可能的原因是所使用的微管蛋白種類不同，前者使用的是α4A-微管蛋白同種型，而后者則使用與mCherry融合獲得的α1B-微管蛋白。因此Aillaud給出如下假設：AGBL5可能對α-微管蛋白的不同種型有一定的選擇性，這也決定了它對蛋白質主鏈和谷氨酸側鏈的作用可能也不盡相同。控制微管蛋白上聚谷氨酸側鏈的長度決定著神經元是否能夠存活[9]，而神經元存活和發育的基本過程與視網膜十分類似[14]，所以AGBL5可能也是通過這種機制影響視網膜的變性。

1.2 AGBL5基因突變和臨床表型在對土耳其一個近親結婚家系的研究中，Kastner等[10]發現3例ARRP患者均為純合錯義突變，在AGBL5基因第883個核苷酸G被A替換，導致第295位的天冬氨酸被天冬酰胺替代。Astuti等[15]報道了在3個不相關的ARRP家系(包括土耳其人和英國人)中鑒定出AGBL5的3種新突變。第一個純合突變為第1775個核苷酸G變為A，導致第592位的色氨酸缺失，進一步使轉錄物經歷無意義介導衰變(NMD)喪失功能，這個突變在ExAC數據庫(exome aggregation consortium)的等位基因中占1/121398(0.0008%)。第2個突變為2例同一家系患者的復合等位基因突變，4條等位基因上均有c.323C>G：p.(Pro108Arg)和c.2659T>C：p.(*887Argext*1)兩種突變。第323位核苷酸C突變為G，第108位脯氨酸改變為精氨酸，相關生物信息學分析中鑒定為致病；第2 659位核苷酸的T突變為C導致終止密碼子的最后1位氨基酸變化，終止密碼子缺失，蛋白質的單個氨基酸殘基延伸。第三個為復合雜合突變[c.752T>G:p.(Val251Gly)和 c.1504dupG:p.(Ala502Glyfs*15)]，在相關生物信息學分析中鑒定為致病的。Patel等[16]在沙特阿拉伯家族的3例RP患者中檢測到AGBL5基因c.826C>T：p.(Arg276Trp)純合突變，該突變在615個沙特外顯子組和ExAC數據庫中均未發現。第276位的親水性精氨酸位于蛋白質的溶劑暴露區域，當其改變為體積較大的疏水性色氨酸時，色氨酸大側鏈與附近的螺旋之間易發生空間碰撞，將疏水性色氨酸暴露于溶劑中的可能性增大，導致蛋白質結構不穩定，生物信息學分析為高度致病性。Branham等[17]運用全外顯子測序技術，在歐洲血統的ARRP家系中檢測到2例患者的AGBL5復合雜合突變(c.841C>T：p.Arg281Cys和c.1459C>T：p.Arg487 *)。錯義突變c.841C>T高度保守，PolyPhen2預測該突變有害，并得到SIFT(sorting intolerant from tolerant)軟件、CADD(combined annotation dependent depletion)數據庫和變異測試儀的進一步支持。c.1459C>T無義突變將缺失外顯子8，產生截短的蛋白質并發生無意義介導衰變(NMD)喪失功能。在ExAc數據庫中c.1459C>T(0.0008%)和c.841C>T(0.004%)突變的頻率極低，在92個歐洲正常人群對照中未發現變異。

AGBL5基因突變相關的ARRP患者，大多在青春期發病，成年時已出現較嚴重的夜盲、視野縮窄和視力下降，除了典型RP表型外可能還合并有白內障、黃斑囊樣水腫和屈光不正。

2 ARHGEF18基因

2.1 ARHGEF18基因定位、克隆和表達ARHGEF18 基因定位于19p13.2，有35個外顯子，編碼產物為Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子18(Rho guanine nucleotide exchange factor 18)，又名KIAA0521、P114-RhoGEF。ARHGEF18蛋白是一種小的GTP酶蛋白，調節RhoA(Ras homology A)活性[18]，是細胞間緊密連接和黏附連接的關鍵組成部分。1998年Nagase等[19]最早將ARHGEF18基因定位于19號染色體。2013年Herder等[20]發現ArhGEF18能夠調控視網膜神經上皮細胞的形態、極性和增殖。

Nagase等[19]從人腦cDNA文庫中獲得了ARHGEF18的克隆，將其命名為KIAA0521。克隆片段推導得到1050個氨基酸的蛋白質，該蛋白與小鼠的鳥苷酸交換因子(ARHGEF)具有顯著的相似性。Blomquist等[21]通過在數據庫中檢索具有ARHGEF特征的蛋白質，進而確定了ARHGEF18的存在，將其命名為p114RHOGEF。對該基因進行推導得到的蛋白質計算分子量為114kD，轉錄產物長約6.4kb，轉錄起始位點上游區域富含GC。該蛋白含有N末端Dbl同源結構域(DH)，緊隨其后的是pleckstrin同源結構域(PH)和富含脯氨酸的C末端區域，這個特征與Rho GTP酶GEF家族其他成員相同。研究中還第1次提出ARHGEF18能與RhoA特異性結合，從而催化RhoA的鳥嘌呤核苷酸交換。Terry等[22]進一步報道了ARHGEF18通過參與RhoA信號傳導，直接控制RhoA的激活進而調節細胞連接的組裝、屏障形成和上皮細胞分化發育的機制。Xu等[23]指出，ARHGEF18是從原始細胞連接過渡到成熟頂端連接所必需的。Loosli[24]發現ArhGEF18是RhoA-Rock2信號傳導通路的關鍵調節因子，對維持脊椎動物視網膜上皮細胞的極性至關重要，ArhGEF18活性喪失將導致胚胎眼的嚴重畸形。

2.2 ARHGEF18基因突變和臨床表型2017年Arno等[25]對899例診斷明確的遺傳性視網膜疾病(IRD)患者進行全外顯子或全基因組測序，發現了3例NSRP患者中的5種ARHGEF18基因突變，其中4個為復合雜合突變，分別位于4個等位基因上(在ExAC數據庫中未找到相同的突變)，另一個為純合突變。患者1是一名37歲女性，無近親婚配和家族病史，檢測到復合雜合突變c.1996C>T:p.(Arg666*)和c.808A>G:p.(Thr270Ala)，其父母為各攜帶一種突變的雜合子。錯義突變c.808A>G:p.(Thr270Ala)經計算機預測發現該突變影響了蛋白質上DBL同源結構域(DH)中高度保守的氨基酸殘基，而DH是RhoA的相互作用和活化所必需的，所以生物信息學分析該突變為有害突變。患者2是一名51歲男性， 檢測到在ARHGEF18 外顯子 16上發生無義突變c.2632G> T(p.Glu878*)和框內缺失 c.2738_2761del(p.Arg913_Glu920del)，由于父母離世DNA樣本無法獲取，因此未進行共分離分析。24bp的框內缺失產生了8個氨基酸的殘基，導致蛋白質高度保守區域部分缺失。患者3的父母為第1代表親近親結婚，無眼病家族史，ARHGEF18基因的替換突變(c.1617+5G>A：p.(Asp540Glyfs*63))是最可能的候選突變，該突變將導致ARHGEF18外顯子8 的框外跳躍，在NHLBI Exome Variant Server數據庫中未發現相同突變報道。

3例患者在30～40歲均出現中心視力下降、視野缺損和輕度夜盲，視力為20/30～20/1250。眼底檢查顯示視盤蒼白、視網膜血管變細和不規則的色素遷移。眼底自發熒光(FAF)成像顯示廣泛的不規則的外周自發低熒光。光學相干斷層掃描(OCT)顯示視網膜內囊腫。ERG檢查表現出嚴重的視網膜功能障礙，視桿細胞受累程度明顯大于視錐細胞。FFA不規則自發熒光、眼底周邊部色素沉著和視網膜的厚度變化與伴CRB1基因突變的RP12型患者類似。 然而3例患者的CRB1基因突變檢測結果均為陰性，對另外10例具有相似視網膜表型的患者進行ARHGEF18基因測序也均未發現任何基因改變。

ARHGEF18基因導致視網膜病變的機制尚未完全了解，可能包括發育和退行性機制。視網膜發育中ARHGEF18功能被破壞的這種假設似乎不能成立，ARHGEF18功能被破壞的結果可能是嚴重的早發性視網膜營養不良，而3例患者在成年期前視覺功能均良好。更合理的假設是光感受器對RhoA-Rock2信號傳導通路所調節的細胞連接敏感性高于其他細胞，導致了成年期視網膜變性的發生。

3 HGSNAT基因

3.1 HGSNAT基因定位、克隆和表達HGSNAT基因定位于8p11.2-p11.1，編碼635個氨基酸的乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷N-乙酰轉移酶(heparan-alpha-glucosaminide N-acetyltransferase)，也稱為跨膜蛋白76。該蛋白催化溶酶體中唯一已知的合成反應：使肝素或硫酸乙酰肝素(HS)乙酰化，將其轉化為α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的底物用于進行下一步降解。由于乙酰基供體乙酰輔酶A(AcCoA)在溶酶體環境中不穩定，因此HGSNAT通過跨膜反應催化HS的乙酰化[26]。硫酸乙酰肝素(heparan sulphate，HS)存在于幾乎所有的細胞膜相關蛋白多糖中，在細胞間的相互作用和信號傳導中起關鍵作用[27]。當HS無法降解而在溶酶體內貯積將導致嚴重的神經變性疾病——黏多糖貯積癥ⅢC型(MPS ⅢC)[28]。

3.2 HGSNAT基因突變和臨床表型HGSNAT基因最先在黏多糖貯積癥ⅢC型(MPSⅢC，也稱為Sanfilippo C綜合征)患者中被發現，Fan等[28]將其命名為TMEM76。MPS ⅢC是一種影響神經組織的典型溶酶體貯積的致死性疾病，其特征是進行性神經系統變性，以遲發性RP的視網膜變性為突出特征。通常在2～6歲發病，6～10歲出現嚴重的神經變性，并在20～30歲左右死亡。目前已知66種突變與MPSIIIC相關[29]。

2015年Haer-Wigman等[30]第1次報道NSRP患者的HGSNAT基因突變。德系猶太裔以色列人(Israeli family of Ashkenazi Jewish，AJ)近親結婚家系中3例RP患者HGSNAT基因第370個核苷酸A錯義突變為T，導致外顯子3的部分跳躍，該突變在同一人群的211例對照研究中未見。在荷蘭家系的3例RP同胞姐弟中發現了復雜的HGSNAT變異，c.[398G> C;1843G>A]在一個等位基因上，c.1843G>A和c.398G>C在另一個等位基因上，產生了c.1843G>A純合突變和c.398G>C雜合突變。c.1843G>A突變經CADD、Mutation Taster和PolyPhen-2進行蛋白質功能預測結果是致病性的，該突變在MPS ⅢC患者中有2次報道[31-32]，均導致HGSNAT酶活性降低50%～80%[33-34]。所有RP患者均以夜盲癥和視野缺損起病，視野表現為環形暗點或周邊缺失伴中心視野敏感度下降。AJ家庭中的3例患者在兒童或青春期發病，在40歲左右被診斷為RP，而荷蘭家庭的患者癥狀直到50～60歲左右才出現。除了RP的典型表現外，有2例患者還伴有紅色覺減弱。此外，患者血白細胞中HGSNAT與健康對照相比活性降低，但仍高于MPS ⅢC患者。因此該報道中提出以下假設：(1)HGSNAT劑量或活性的微小變化就足以導致視網膜發生病變，這已在與多系統溶酶體貯積病相關聯的其它基因中多有描述(如CLN3[35]和MFSD8[36])。(2)視網膜相比于MPS ⅢC相關的其他組織(例如腦)，需要更高的HGSNAT活性以維持其功能，同樣的現象在其它基因中已被報道(如USH2A、CEP290和BBS1等)[37-39]，這些基因的嚴重突變通常與綜合征遺傳性視網膜變性疾病(IRD)相關，而較輕的突變則與非綜合征IRD相關。Van Cauwenbergh等[40]在RP男性患者上發現復合雜合突變，在一個等位基因上鑒定了已知外顯子18中的突變：c.1843G>A：p.(Ala615Thr)，在另一個等位基因上發現了新的HGSNAT基因突變c.634-408_820+338delinsAGAATATG：p.(Glu212Glyfs*2)導致外顯子7和8的2.5-kb缺失。Comander等[41]在43例患有旁中央性RP(pericentral RP)的先證者隊列中，發現HGSNAT確定為4例旁中央性RP患者的致病原因，2例為c.1843G>A：p.(Ala615Thr)純合突變患者，1例為c.953G> A：p.Ser318Asn純合突變患者，1例為(c.1843G>A：p.Ala615Thr和c.1464+1G>A：p.?)復合雜合突變。該研究結合既往Haer-Wigman等[30]、Van Cauwenbergh等[40]報道中發表的患者臨床檢查圖片，發現所有HGSNAT基因突變的RP患者眼底表現有一定相似性，病變首先影響靠近旁中央部的視網膜，因此HGSNAT可能是導致旁中央性RP的常見基因，應被列入非綜合征的RP基因檢測PANEL中。

4 ZNF408基因

4.1 ZNF408基因的定位、克隆和表達ZNF408基因又名PRDM17基因，編碼鋅指蛋白408/PR結構域鋅指蛋白17，屬于鋅指轉錄因子家族。相關研究預測ZNF408是在血管發育中起作用的轉錄因子，具體作用機制有待研究，但可以肯定的是ZNF408基因抑制將導致視網膜血管發育障礙等異常。

Collin等[42]最早在2013年將該基因定位于染色體11p11.2，含有5個外顯子，由該基因推導得到含720個氨基酸的ZNF408蛋白具有一個N末端SET結構域和10個C2H2型鋅指結構域。SET結構域參與蛋白質之間的相互作用，鋅指結構域將識別并結合多功能DNA，進而參與胚胎發育和細胞分化等多種細胞活動。定量RT-PCR分析在11個成人人體組織中檢測到ZNF408表達，視網膜中表達最高，是其他組織的30倍。Collin等還誘導形成斑馬魚ZNF408基因抑制模型，發現該斑馬魚的視網膜和軀干血管系統發育缺陷，為ZNF408基因突變導致人類視網膜血管異常提供了證據支持。運用免疫組織化學分析技術、雙免疫標記技術還發現ZNF408在健康成人視網膜的外核層(ONL)中表達最強，神經節細胞層和內外叢狀層(IPL、OPL)也有表達，在光感受器細胞中特異性表達而Müller細胞中未見，并且在視網膜血管上表達[43]。

4.2 ZNF408基因突變和臨床表型Avila-Fernandez等[43]報道了3例西班牙家系的ARRP患者ZNF408基因存在2種突變，這些突變在1000 Genomes Project數據庫、Exome Variant Server數據庫和374個同種族對照中均未發現。來自同一家系的2例姐妹ZNF408 基因第358、359個核苷酸的G和T缺失，導致外顯子3移碼突變。另一家系中的男性患者ZNF408 基因第1 621個核苷酸C被T替換，導致第541位高度保守的殘基處精氨酸被半胱氨酸取代。其父母為近親結婚，其兒子和女兒都是雜合子未見視網膜血管異常。Habibi等[44]在一個突尼斯家系中發現3例NSRP患者，均為內含子4受體剪接位點的純合突變c.(653-1G>T)，他們近親結婚的父母是為雜合突變未受影響。Biswas等[45]對巴基斯坦起源的ARRP家系進行全外顯子分析，發現ZNF408基因c.1304G>A:p.Arg435Gln純合錯義突變，在同種族對照染色體中未見相同突變。

另外，ZNF408基因還與家族性滲出性玻璃體視網膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)相關，患EVR 6型的荷蘭家系中，鑒定了ZNF408 基因中雜合錯義突變c.1363C>T;p.(His455Tyr)。在患有EVR6型的日本男性中檢測到潛在的致病性雜合錯義突變c.377G>A.p.Ser126Asn[43]。

目前已知ZNF408基因有3種突變類型與RP相關，分別為c.358_359delGT;p.(Ala122Leufs*2)，c.1621C-T:p.(arg541cys)和c.653-1G>T。所有患者的首要癥狀是夜盲和視野縮窄，發病年齡為20～40歲，均有視力下降、視野縮窄，部分患者伴有高度近視、后囊下白內障、眼底視盤蒼白、血管變細、骨細胞樣色素沉著、ERG不可記錄或顯著降低。值得注意的是，所有RP患者均伴玻璃體輕度異常，這個特征在其他RP表型中并不常見，為臨床診斷ZNF408相關RP提供了一定的參考。

5總結

RP是一類遺傳性致盲性眼病，目前尚無有效的防治方法，通過對RP家系的研究、人類基因組計劃的進展和大規模測序的完成，越來越多的RP相關基因被定位和克隆，基因診斷和產前診斷將得到廣泛應用。近年來基因治療也陸續開展，已上市的Luxturna用于治療RPE65基因突變相關疾病，CNGB3、REP1、CHM、RPE65、ND4、RS1、MERTK、RPGR、ABCA5、ABCA4等基因治療也正在進行臨床試驗[46]。在未來的研究中，定位新的致病基因、深入研究基因的功能和作用通路、了解其分子生物學和遺傳學機制，對于探索新的治療途徑和預防措施都有著重要意義。