卵 巢 早 衰 的 細 胞 療 法 研 究 進 展▲

黃秋艷 楊一華 譚 瑩 劉 博 覃愛平

(廣西醫科大學第一附屬醫院生殖中心，南寧市 530021，電子郵箱：445642639@qq.com)

【提要】 卵巢早衰的發病率呈逐年上升趨勢，從根本上修復卵巢早衰患者的卵巢功能，解決其生育問題是生殖醫學的難點。近年來，有學者嘗試使用細胞療法治療卵巢早衰，取得一定的效果。本文就卵巢早衰相關細胞療法的種類、機制、效果及存在的問題進行綜述。

卵巢早衰指女性在40歲前發生卵巢功能衰竭，出現原發性或者繼發性閉經，伴有促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，以及圍絕經期表現等[1]，被認為是早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)中病情最嚴重的亞型[2]。全球40歲以下的女性人群中，約1%受卵巢早衰困擾[2-3]。卵巢早衰是導致女性不孕的重要疾病之一，其病因包括染色體異常、放化療損傷、卵巢手術操作史、代謝異常、免疫調節異常、氧化應激、環境因素等[1，4-5]，目前最常見的治療方法為補充激素治療[1]，但是該方法無法解決患者的生育問題，還導致部分患者乳腺癌等疾病的發病風險增加[6]。其他方法包括心理支持、脫氫表雄酮、輔酶Q、褪黑素、免疫治療以及改善生活方式等，但均不能從根本上修復卵巢功能，常需要借助贈卵來解決患者生育問題[5]。近年來，有學者使用以干細胞為核心的細胞療法治療卵巢早衰及POI，取得一定療效[7-8]，包括間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)、人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)、卵巢生殖干細胞(ovarian germline stem cell,OGSC)、胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)以及單核細胞等。本文就相關細胞療法治療卵巢早衰的研究進展進行綜述。

1 MSC

MSC是來源于中胚層中具有多向分化潛能的成體干細胞，最早被發現于骨髓中[9]，其具有多向分化、造血支持、低免疫原性、旁分泌及“歸巢”等特點[10]，可誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和生殖細胞等[9]。MSC治療卵巢早衰的機制主要有：(1)在添加各類生長因子例如視黃酸、骨形態發生蛋白4、骨形態發生蛋白8b及轉錄生長因子β1共培養條件下，MSC可分化成生殖樣細胞[7]。研究發現，移植骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)可歸巢至受損部位，其可分化成為新的顆粒細胞或者具有分泌營養功能的生殖細胞，而不是卵母細胞[8]，但是MSC可能參與了卵母細胞的修復和合成[11]；(2)MSC通過上調B淋巴細胞瘤2[12]，下調B淋巴細胞瘤2相關X蛋白、半胱氨酸蛋白酶3[12-13]和半胱氨酸蛋白酶9[14]的表達，減少顆粒細胞的凋亡；(3)MSC旁分泌各種細胞生長因子如血管內皮生長因子、肝細胞生長因子1、成纖維細胞生長因子2、轉化生長因子β等，與細胞的存活、增殖、遷移以及血管的形成等有關[8，12，15-16]；(4)MSC可促進調節性T淋巴細胞的分化而在免疫抑制中發揮重要作用[17]；(6)MSC有助于卵巢抗氧化、抗纖維化[8，16]。研究表明，MSC具有向損傷組織遷移并定植(即“歸巢”)的特點，“歸巢”后可修復組織功能[11，18-19]，靜脈注射和卵巢原位注射MSC均能修復卵巢早衰所致的內分泌紊亂[11，20]。目前用于治療卵巢早衰的MSC細胞主要有以下幾類。

1.1 BMMSC BMMSC來源于骨髓內，是最早發現的MSC[9，21]。BMMSC具有良好的分化性能及低免疫原性，采集便利，目前將其用于促進生育力恢復的研究較多[7-8]，且其在卵巢早衰的治療中取得較好效果[8]。Edessy等[22]報告，一名染色體異常所致卵巢早衰患者接受BMMSC卵巢體內移植后成功妊娠。但也有研究顯示，隨著年齡增長，BMMSC的細胞數量和擴增分化能力呈下降趨勢[21]，且骨髓穿刺為有創性操作，會增加患者疼痛、感染等風險。

1.2 人臍帶間充質干細胞 臍帶血內含有胎兒生長發育期間產生的多種未成熟細胞，人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，HUC-MSC)主要來源于臍帶組織或臍帶血，取材方便，對供者無不利影響，便于保存，道德倫理限制性小，且與輸注干細胞相關的病毒和病原微生物感染率遠低于BMMSC[13]。HUC-MSC低表達主要組織相容性復合體Ⅰ，不表達主要組織相容性復合體Ⅱ，因此具有低免疫原性[23]。孫海翔等[24]將HUC-MSC移植入6例卵巢早衰患者，其中有1例在術后1個月開始恢復排卵，并自然受孕分娩1名健康嬰兒。

1.3 脂肪間充質干細胞 脂肪組織具有來源豐富、取材損傷小、低免疫原性、穩定增殖等優點[25]。多項卵巢早衰動物模型研究證實，脂肪間充質干細胞治療卵巢早衰的效果較好[11，26-27]。體外研究表明，人源脂肪間充質干細胞聯合雌激素可促進POI患者外周血中調節性T淋巴細胞的分化[28]。Fang等[29]研究報道，將自體脂肪間充質干細胞經陰道腹腔鏡注入4例卵巢早衰患者卵巢中，術后有2例患者恢復排卵，尿促卵泡素下降，雌二醇升高。

1.4 月經血來源間充質干細胞 月經血收集方便且無創，月經血來源間充質干細胞具有與其他MSC一樣的特性，包括自我更新、高增殖率和多分化能力[30]。部分動物研究證實，月經血來源間充質干細胞可促進卵巢早衰模型動物卵巢功能的恢復[16，31]。但因月經血采集多為供體自行采集，陰道解剖環境的特點增加了月經血來源間充質干細胞制備過程中的生物污染風險。目前相關的研究主要集中在動物研究，尚未見相關臨床研究報道。

1.5 其他來源MSC 其他來源的MSC如人胎盤間充質干細胞[17，19]、人羊膜間充質細胞[32]、皮膚間充質干細胞[33]等，移植后均有助于卵巢早衰動物模型卵巢功能的恢復，但均未進入臨床相關研究。

2 單核細胞

單核細胞富含造血干細胞、內皮祖細胞等，有助于組織再生，可用于組織器官再生及修復、促進血管新生、改善局部微環境及內分泌組織的功能等[34-35]。研究表明，單核細胞有助于卵泡再生，可誘導新的卵巢生殖細胞發展至減數分裂階段及形成顆粒細胞[36]。臨床研究中，MSC需體外擴增培養或通過特殊細胞分子標志物，借助免疫磁珠、流式細胞分選等萃取[9]；而單核細胞制備快捷，無須體外擴增，能實現自體移植，臨床應用及推廣空間較大，近年來相關研究亦較多，包括應用于缺氧性腦癱[37]、缺血性心臟疾病[38]、肢體缺血[39]等。

2.1 骨髓單核細胞 骨髓單核細胞又稱為骨髓源干細胞(bone marrow-derived stem cell，BMDSC)，一般采用Ficoll分離液等自骨髓液分離制備。動物研究顯示，將BMDSC經尾靜脈注入化療所致卵巢早衰的小鼠體內，可產生不成熟的卵泡[40]。Herraiz等[41]將粒細胞集落刺激因子動員后的人源性BMDSC注入卵巢早衰小鼠的卵巢組織，可產生高質量的排卵前卵泡、二級優胚、2細胞胚胎以及健康的子代。有研究報道，一名45歲POI患者經腹腔鏡下移植自體BMDSC，術后2個月恢復自然排卵，行體外受精-胚胎移植后成功妊娠并分娩一名健康男嬰[35]。

2.2 外周血單核細胞 外周血單核細胞由外周血分離提取，正常外周血中含有極少量的干細胞，粒細胞集落刺激因子可將骨髓內祖細胞動員至外周血循環中[42]，動員后采集的外周血單核細胞內含有造血干細胞、MSC、內皮祖細胞、淋巴細胞、粒細胞、成纖維細胞等[34]。El Andaloussi等[43]將粒細胞集落刺激因子動員的外周血單核細胞經靜脈輸注入卵巢早衰小鼠后，小鼠體內與卵巢修復相關的標志物CD34、血管內皮生長因子等表達上調，動情周期改善、卵泡發育增多，生育力恢復且產仔數量明顯增加，與BMDSC作用類似。本課題組前期研究顯示，粒細胞集落刺激因子動員的外周血單核細胞經卵巢注射移植入POI大鼠，可使大鼠顆粒細胞的凋亡減少，卵巢血管新生增加，竇前卵泡發育增多，有助于卵巢功能恢復[44]。

2.3 臍帶血單核細胞 臍帶血富含多種未成熟細胞[13]。Dang等[45]將人源臍帶血單核細胞成功移植入卵巢早衰裸鼠的卵巢中，4周后觀察到小鼠卵泡增多，性激素水平改善，卵巢功能恢復，但是臍帶血單核細胞含有的細胞成分較多，異體移植免疫排斥反應大。

3 hiPSC

hiPSC與ESC具有相似的多向分化潛能。Liu等[46]采用多種細胞生長因子和雌激素誘導hiPSC體外分化為卵巢顆粒樣細胞，然后移植入卵巢早衰小鼠，其可以促進卵巢組織的修復及卵泡的發育。hiPSC需要在體外擴增培養、添加誘導因子等，目前臨床上將hiPSC用于治療卵巢早衰的研究較少。

4 OGSC

在小鼠、大鼠、人類中均存在OGSC[47]。Wu等[48]用免疫磁珠法提取5日齡小鼠的OGSC并移植入卵巢早衰小鼠的卵巢中，觀察到供體的OGSC歸巢到卵巢皮質邊緣后分化為早期卵母細胞，隨后產生修復卵巢功能的作用，最終恢復懷孕并產下健康的子代。關于OGSC的相關研究結果顛覆了既往傳統的卵巢內無生殖干細胞的觀點，但目前相關研究仍較少，今后還需進一步研究探討。

5 ESC

因倫理爭議較大，近年來卵巢早衰與ESC相關的研究相對較少。有學者發現羊水間充質干細胞表達ESC的標志物(八聚體結合轉錄因子4)，且羊水間充質干細胞的增殖速度比MSC快，將羊水間充質干細胞移植入卵巢早衰小鼠可減少顆粒細胞的凋亡[49]。羊膜表皮細胞亦可通過旁分泌等改善卵巢功能[50]。羊水間充質干細胞和羊膜表皮細胞的倫理限制相對較小，但是與羊膜間充質細胞相比，羊膜表皮細胞更易引起免疫排斥反應，且其改善卵巢功能的效果不如羊膜間充質細胞明顯[32]。

6 小 結

目前卵巢早衰的各類細胞療法的治療仍集中在動物實驗，其在臨床研究中取得的成果有限，更多的研究還在探索中。目前已報道的研究中，未出現不良反應及安全問題報道，經細胞療法治療后所生育的子代亦未見畸形及其他不良影響報道，但是今后的卵巢早衰細胞療法仍需關注以下問題：(1)目前仍缺乏細胞療法的計數、使用劑量、細胞活力檢測、使用途徑的優化研究，各類臨床試驗的劑量迥異，未來可嘗試選擇采集更方便、效果更優的細胞治療方法，以及更高效的干預方法等；(2)免疫排斥反應，異體細胞移植排斥反應大，自體細胞移植能最大限度減少排斥反應的發生[8]；(3)保存一定數量的細胞且具有較高的細胞活力是細胞治療成功的關鍵，在臨床實踐中需探索如何減少制備時細胞的損耗、污染以及其他可能影響細胞活力的因素；(4)現有的各項研究多為小樣本、分散的研究，觀察周期較短，今后細胞治療卵巢早衰的進一步推廣及應用需更大樣本以及更長時間的研究數據支持。