天然柿霜上的真菌多樣性研究

王天琪，孫曉東，王 輝，關海雯

（大連民族大學 環境與資源學院，遼寧大連116600）

柿餅是一種歷史悠久的休閑食品，距今已有1 000多年的歷史。北魏賈思勰《齊民要術》中記載：“柿熟時取之，在灰汁燥再三，度干，令汁絕，著器中，經十日可食。”可見柿餅源遠流長，直到現在依舊是人們冬季日常生活中的休閑食品，深受消費者青睞。柿餅中富含磷、鈣、碘、蛋白質和各類維生素，能有效治療腸胃不足，解酒毒，壓胃熱[1]。將成熟柿子去皮后，于日光下晾曬數日，柿子果肉內的成分逐漸外滲，伴隨著水分蒸發，在其表面逐漸形成干燥的白色結晶，即柿霜[2]。《本草綱目》中記載：“柿霜乃其津液，生津化痰，清上焦心肺之熱，治咽喉口舌瘡痛。”可見柿霜對喉痛咽干、口腔炎、肺熱咳痰等癥有非常顯著的療效[3-4]。柿霜的主要成分是糖類，其形成的過程又是在開放的環境中完成，因此，柿霜中必然蘊藏著豐富的真菌資源。本研究從4個主要柿餅產區陜西富平、桂林恭城、山東臨朐、山西運城采集新鮮制成的柿餅12份，采用直接分離和稀釋分離2種方法對柿霜上的真菌多樣性進行研究，研究結果為評價柿霜的食品安全性及發現功能性菌株奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

12份柿餅樣品分別采自陜西富平、桂林恭城、山東臨朐、山西運城4個柿餅產地，每個產地采集3份不同地點的柿餅樣品，每份樣品0.5 kg。在采集時間上選擇剛剛完成制作并未經儲藏的柿餅，最大程度上保證了柿餅樣品的新鮮程度，之后立即拿回實驗室進行真菌的分離和培養。

孟加拉紅培養基和PDA培養基由北京陸橋技術股份有限公司提供；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；酵母基因組DNA快速抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純由天津科密歐化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

奧林帕斯CX21顯微鏡出自日本奧林帕斯公司；XFH-75C電熱式壓力蒸汽滅菌鍋出自深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺出自蘇州凈化設備有限公司；6-16KS臺式高速離心機出自德國SIGMA公司；凝膠成像系統出自美國UVP公司；MG96 PCR儀出自杭州朗基科學儀器有限公司；DY-20D電泳系統出自北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分離方法和培養基的選擇 研究采用了直接分離和稀釋分離2種方法。選取孟加拉紅培養基為分離培養基，PDA培養基為純化培養基。

直接分離法：仔細觀察柿餅表面，選擇不同部位用滅過菌的刀片刮取少量的柿霜置于孟加拉紅培養基上，用滅過菌的棉簽分散均勻，10℃暗光培養至培養基上長滿真菌菌落。每個樣品3次重復。

稀釋分離法：取2支裝有9 mL無菌水的試管，分別編號1、2。用上述同樣的方法選取柿餅不同部位刮取柿霜，每個樣品的刮取量為1 g。將刮取的柿霜放入1號試管中，使其充分混勻，吸取1 mL溶液放入培養皿中，隨后倒入40℃孟加拉紅培養基，此時柿霜被稀釋了10倍。吸取1 mL 1號試管的溶液倒入2號試管中，混合均勻后吸取1 mL溶液放入培養皿中，隨后倒入40℃的孟加拉紅培養基，此時柿霜被稀釋了100倍。10℃暗光培養至培養基上長滿真菌菌落。每個樣品3次重復。

1.3.2 菌株的純化和保存 將長出的單菌落轉入PDA培養基上純化，25℃培養7 d。純化后的菌株轉入30%的甘油小管80℃溫度條件下長期保存。

1.3.3 菌株的形態學鑒定 對純化后的菌株在顯微鏡下觀察形態特征，其中產孢方式、產孢細胞的大小、形態以及孢子的形態、大小、隔膜、表面的紋飾等都是重要的分類依據。菌落特征在鑒定中也可以參考。研究對分離獲得的所有絲狀真菌都進行了形態學鑒定[5-10]，對無法鑒定到種的菌株、細菌和酵母菌均進行了分子生物學鑒定。

1.3.4 分子生物學鑒定 所有菌株的基因組DNA均采用試劑盒提取，提取后的DNA樣品送到上海生工生物工程有限公司進行PCR擴增和擴增產物的測序。采用的引物有ITS（ITS1/ITS4）、16S（27F/1492R）和 NL（NL1/NL4）分別擴增絲狀真菌、細菌和酵母菌的特異性區域。測序結果在Genebank里比對，選取相似度為100%的結果，結合形態學特征，確定菌株的分類地位。

2 結果與分析

經形態學和分子生物學鑒定共獲得真菌20屬30種，研究獲得了1株細菌Pseudomonas psychrophila，各樣品中的真菌類群詳見表1。

由表1可見，Penicillium、Cladosporium、Alternaria，這3個屬的真菌幾乎存在于所有的樣品中，是柿霜上普遍存在的優勢類群，而其他種類Rhizopus、Trichoclerma、Fusarium也大量存在于各地的樣品中。研究獲得了相當數量的酵母菌，其中Metschnikowia、Debaryomyces、Cryptococcus 是 酵 母菌中的優勢類群，存在于多地的樣品中，采自于山西的樣品SX1中同時分到了這3種酵母。Aureobasidium 存在于 SX3、SD2、G3、FZ1 四個樣品中，這種菌被報道可以產生普魯蘭多糖、胞外多聚糖類、胞外酶類、黑色素、β-聚蘋果酸、嗜鐵素、L-山梨醇等一系列物質，這些物質廣泛應用于醫藥、食品、生物防治、化妝品工業和煙草制造工業等眾多領域[11]。

從生物量的角度評價，山東和富平的樣品分離出的真菌數量要遠遠小于桂林和山西的樣品，而柿霜上物種的多樣性桂林是最少的，其他3個地區都擁有相當數量的真菌種類。

研究采用了孟加拉紅培養基作為分離培養基，從很大程度上抑制了細菌和放線菌的生長，更好地還原了柿霜中真菌的多樣性。unidentified Saccharomycetes是桂林的3個樣品中分離得到的幾株酵母菌，因為壁厚無法有效地破壁提取基因組DNA，目前無法確定其分類地位。

3 討 論

本研究發現，柿霜中的真菌豐富多樣，以絲狀真菌為主，還有很多種類的酵母菌，不同地區的樣品都有自己獨特的真菌組成。這些真菌中的很多類群都參與了食品的發酵過程，如Rhizopus在醬油、酒曲的發酵中被廣泛地應用；Debaryomyces被用于紅酒、肉類和奶酪的發酵生產；Penicillium作為重要的發酵功能菌株參與到了奶酪、葡萄糖氧化酶的工業化生產中[12-13]。作為功能性菌株，這些真菌在發酵過程中起的作用至關重要。而存在于柿霜表面的真菌，哪些營腐生生活，哪些參與到了柿霜的形成過程還沒有相關的報道，要了解它們的作用還需要進行深入的研究。

表1 樣品中檢出的真菌種類