偏痛湯1號化學成分的UHPLC-LTQ-OrbitrapMSn快速鑒定研究※

● 王春國 宋慧榮 羅亞敏 李伊然 周冉冉 陶曉華

偏痛湯1號是北京中醫藥大學陶曉華教授治療偏頭痛的系列方之一，是在幾十年的臨床實踐以及在其協定處方偏痛湯的實驗和臨床研究[1-2]基礎上加減而成，該方由川芎、蔓荊子、地龍、僵蠶、珍珠母、夏枯草、紅花、雞血藤、細辛、白芍、甘草組成，具有化痰降濁、祛瘀止痛、升清疏散的作用，臨床中對風痰互結、瘀濁內阻，又見清陽失布的偏頭痛具有確切療效。現代藥理研究表明，偏痛湯1號對偏頭痛模型大鼠具有明確的藥效作用，其機制可能與其調節偏頭痛神經源炎癥反應的神經肽CGRP 蛋白表達下調，抑制CGRP 下游效應分子前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)的高表達有關[3]。方中川芎、蔓荊子為君，善活血行氣、祛風止痛，協同為用。地龍、僵蠶、珍珠母、夏枯草、紅花、雞血藤共為臣藥，化痰降濁、祛瘀止痛。細辛，入陰經，引藥上行；白芍、甘草，取仲景甘酸化陰、緩急止痛之意，共為佐使。其中蔓荊子性清揚升散，引藥上達巔頂，且止痛清熱、利頭目，為治療頭痛之要藥，藥理研究表明其有明顯解熱、鎮痛、降壓作用，其中紫花牡荊素為抗炎的主要活性成分之一[4]。細辛性溫，善祛在里之風邪，除少陰之疼痛，藥理研究表明其揮發油有顯著的解熱作用，所含成分β-細辛醚能降低血小板的活性，抑制血小板的聚集和黏附[5]。甘草可緩急止痛，治療疼痛病之要藥，藥理研究表明其中的甘草次酸具有抗炎作用[6]。經臨床應用和拆方研究，發現這三味藥與偏頭痛的療效存在一定關系，對其進行復方中化學成分的提取和研究分析對今后臨床治療偏頭痛有一定的參考價值。

偏痛湯1號中所含化學成分復雜，而對其化學成分的分析和闡釋能夠為偏痛湯1號的藥效物質基礎研究、新藥開發、質量控制、體內代謝過程等提供數據參考，但是目前尚未有對偏痛湯1號化學成分分析的報道，嚴重阻礙了偏痛湯1號的進一步開發利用。LTQ-Orbitrap MS是將線性離子阱質譜和高分辨質譜結合的雜交型質譜儀，同時具有離子阱質譜的多級碎裂和Orbitrap的高分辨性能，是復雜中藥化學成分定性研究的有力工具。本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術建立偏痛湯1號提取物中化學成分快速分析和鑒定的方法，鑒定其主要化學成分，歸屬其可能的質譜裂解行為，并對偏痛湯1號中蔓荊子、甘草和細辛三味中藥的特征性成分進行指認和歸屬，以期為偏痛湯1號的藥效物質基礎研究、質量控制和化學成分的快速鑒定提供參考。

1 試驗材料

LTQ-Oribitrap XL線性離子阱-串聯靜電場軌道阱質譜儀：配有熱噴霧離子源(HESI)、Xcalibur 2.1化學工作站(美國Thermo Scientific公司)；DionexUtimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色譜系統：含二元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱，DAD檢測器(美國Thermo Scientific公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)；Sartorious BT 25S 型萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；超聲波清洗器(北京中晟名科技有限公司，100 W)；0.22 μm微孔濾膜(天津市津騰實驗設備有限公司)；甲酸、甲醇(質譜純，Fisher 公司)。

偏痛湯1號顆粒、蔓荊子顆粒、蔓荊子陰性顆粒、炙甘草顆粒、炙甘草陰性顆粒、細辛顆粒、細辛陰性顆粒購于北京中醫藥大學東方醫院藥房；甘草素(成都普菲德生物技術有限公司，批號：150511)；葒草苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111777-200801)；甘草次酸(寶雞國康生物科技有限公司，批號 111215)。

2 實驗方法

2.1色譜條件色譜柱AQUITY UPLC C18柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：0.1% 甲酸水溶液(A)，乙腈溶液(B)；梯度洗脫條件：0 ～ 3 min (5 % ～ 5 % B)，3 ～ 45 min (5% ～ 75% B)， 45 ～ 45.1 min (75% ～ 5 % B)，45.1 ～ 50 min (5 % ～ 5 % B)；流速： 0.3 mL/min；進樣量： 2 μL；柱溫：35℃。

2.2質譜條件正離子檢出模式：HESI離子源，離子源溫度350℃，電離源電壓4 KV，毛細管電壓：35V，管透鏡電壓110V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速20 arb；負離子檢出模式：HESI離子源，離子源溫度350℃，電離源電壓3 KV，毛細管電壓35V，管透鏡電壓110V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb。

正負離子數據采集均使用傅里葉變換高分辨全掃方式(TF，Full scan，Resolution 30000)數據依賴性(data-dependent acquisistion)ddMS3，運用CID碎解方式。

2.3供試品溶液的制備(1)偏痛湯1號供試品溶液制備：取偏痛湯1號顆粒劑約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理40 min，再稱定重量，用50% 補足減失的重量，搖勻，濾過，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。(2)蔓荊子供試品溶液的制備：取蔓荊子顆粒約2 g，按上述同法制備。(3)蔓荊子陰性供試品溶液的制備：取除去蔓荊子的偏痛湯1號顆粒約2 g，按上述同法制備。(4)炙甘草供試品溶液的制備：取炙甘草顆粒約2 g，按上述同法制備。(5)炙甘草陰性樣品的制備：取除去炙甘草的偏痛湯1號顆粒約2 g，按上述同法制備。(6)細辛供試品溶液的制備：取細辛顆粒約2 g，按上述同法制備。(7)細辛陰性供試品溶液的制備：取除去細辛的偏痛湯1號顆粒約2 g，按上述同法制備。

2.4對照品溶液的制備精確稱取甘草素、葒草苷、甘草次酸適量，用甲醇溶解，配置濃度為1mg/mL的標準品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

3 結果與討論

按照上述方法分析偏痛湯1號提取物，得到其在正、負離子模式下的總離子流圖(見圖1 A)。根據LC-MS檢測得到的各化學成分保留時間、高分辨精確分子量、MSn多級碎片信息，并結合提取離子流圖與標準品信息、Scifinder數據庫及相關文獻對其進行成分確認，共鑒定了126個成分，其中在正離子模式下所鑒定的數目為61種，負離子模式下所鑒定的數目為112種，47種化合物為正、負離子所共同鑒定的化合物(見圖1B)。所鑒定得到的126種化學成分，包含57種黃酮類成分，14種三萜類萜類成分，14種酚酸類成分，10種單萜類成分，3種二萜類成分，8種香豆素類成分，4種木脂素，4種生物堿類成分和12種其它類成分(見圖1C)。其中，通過對照品比對鑒定的化學成分有：甘草素、葒草苷、甘草次酸。

圖1 LTQ-Orbitrap MS對偏痛湯1號主要化學成分的鑒定結果

注：A 偏痛湯1號在正離子和負離子模式下的總離子流圖；B 正離子模式和負離子模式下鑒定偏痛湯1號化學成分的數目；C LTQ-Orbitrap MS鑒定偏痛湯1號中主要成分的類型

3.1標準品的質譜裂解行為黃酮類化合物：標準品甘草素在HESI負離子模式下，顯示準分子離子峰為m/z255.06589 [M+H]-，元素組成為C15H12O5(質量誤差-0.92ppm)。在MS/MS中產生m/z211.08、149.02、135.01、119.05等碎片離子(見圖2 A)，其中碎片離子m/z135.01、119.05，是黃酮類化合物RDA1，3A-裂解產生的互補離子；選擇豐度最高的m/z135.01進一步進行CID裂解，在MS3中產生的碎片離子主要為m/z90.87，為碎片m/z135.01母核丟失一分子CO2所形成，其具體的質譜裂解行為見圖2 B。標準品葒草苷在HESI負離子模式下，其準分子離子峰為m/z447.09302 [M+H]-，元素組成為C21H20O11(質量誤差-0.5815 ppm)，LTQ-Orbitrap多級質譜分析，MS2中呈現m/z327.05081，357.06116、429.08286等碎片離子(見圖2C)。其中m/z429為準分子離子丟失一分子H2O所形成，m/z327.05081和357.06116是有黃酮碳苷鍵中葡萄糖不同的跨環裂解所形成的碎片離子，選擇豐度最高的m/z327.05081進一步進行CID裂解，在MS3中產生的碎片離子主要為m/z299、255等，為黃酮母核中性丟失CO和CO2所形成，其具體的質譜裂解行為見圖2 D。

三萜類化合物：標準品甘草次酸在HESI負離子模式下，顯示準分子離子峰為m/z469.33133 [M+H]-，元素組成為C30H46O4(質量誤差-2.13ppm)。在MS/MS中產生m/z451、425.34、409.31，355.26等碎片離子(見圖2E)，其中碎片離子m/z451是準分子離子丟失一分子H2O所形成，碎片離子m/z425是甘草次酸C30位羧酸斷裂丟失一分子CO2所形成，進一步丟失甲基(CH4)形成m/z409.31的碎片。選擇豐度最高的m/z425.34進一步進行CID裂解，在MS3中產生的碎片離子主要為m/z355，為甘草次酸E環跨環碎裂丟C5H10所形成，其具體的質譜裂解行為見圖2 F。

圖2 標準品的MSn圖和質譜裂解行為

注：A甘草素的MS2-3質譜圖；B甘草素的質譜裂解行為圖；C 葒草苷的MS2-3質譜圖；D 葒草苷的質譜裂解行為圖；E甘草次酸的MS2-3質譜圖；F甘草次酸的質譜裂解行為圖

3.2黃酮類化合物鑒定峰2和3的保留時間為13.05和18.54 min，其準分子離子峰均為m/z417.11859 [M+H]-，推測其元素組成為C21H22O9(質量誤差-1.23 ppm)。在MS/MS中產生m/z255、135、119等二氫黃酮類化合物的典型碎片離子(見圖3)，峰2和3的準分子離子峰與標準品甘草素相差162Da，推測為甘草素的單葡萄糖苷，通過文獻比對，鑒定該化合物為甘草苷(Liquiritin)和新甘草苷( Neoliquiritin)[7]。峰4、5、7、8、9和10保留時間分別為18.22、13.84、21.76、19.84、19.73和10.84 min，其準分子離子峰分別為m/z549.16077、579.17092、692.19847、725.20764、695.19678、711.21307[M+H]-，推測元素組成分別為C26H30O13(質量誤差-1.07 ppm)、C27H32O14(質量誤差-1.72ppm)、C35H35NO14(質量誤差-0.01 ppm)、C36H38O16(質量誤差-1.47 ppm)、C35H36O15(質量誤差-1.96ppm)、C32H40O18(質量誤差-1.57 ppm)。這些峰在MS/MS中均出現m/z255二氫黃酮苷元的碎片離子峰，由此推測這些峰為甘草素(m/z255.06589 [M+H]-)連接不同糖苷鍵或相關官能團的同系組分，峰4與甘草苷相差132 Da，與甘草素相差294 Da(一分子葡萄糖和一分子呋喃糖)，結合文獻鑒定為Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside[8]；峰5與甘草苷相差162 Da，與甘草素相差324 Da(兩分子葡萄糖)，結合文獻鑒定為Liquiritigenin 7，4'-diglucoside[9]；峰7與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差143 Da，且峰7準分子離子峰為偶數，根據氮規則，推測其含有一個N元素，并結合文獻鑒定其為Licorice glycoside E[10]；峰8與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差146 Da，推測碎片為苯乙烯酸結構，結合文獻鑒定為Licorice glycoside D1[10]；峰9與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差176 Da(苯乙烯酸衍生物)，結合文獻鑒定為Licorice glycoside C1[10]；峰10與Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差162 Da(一分子葡萄糖)，結合文獻鑒定為Liquiritigenin 7-glucoside-4'-apiosyl-(1->2)-glucoside[11]。

在HESI負離子模式下，峰16、17、18、19、20和21保留時間分別為15.2、11.50、11.84、12.80、12.90和14.62 min，其準分子離子峰分別為m/z473.10893、593.15002、579.13464、579.13464、563.13977、 577.15521 [M+H]-，推測元素組成分別為C23H22O11(質量誤差-0.01 ppm)、C27H30O15(質量誤差-1.97 ppm)、C26H28O15(質量誤差-1.56 ppm)、C26H28O15(質量誤差-1.56 ppm)、C26H28O14(質量誤差-1.52ppm)、C27H30O14(質量誤差-1.85 ppm)。這些峰在MS/MS中均出現一個或多個[M-120]-和[M-90]-的碎片離子峰，推測這些峰為黃酮碳苷類化合物。結合文獻鑒定這些峰分別為：Vitexin 2''-acetate，Vicenin 2，Lucenin 1，Lucenin 3，Vicenin 1，Violanthin[12-14]。綜上，基于標準品的裂解規律、高分辨質譜提供的精確分子量、MSn多級碎片信息等，在正離子和負離子模式下共有56種黃酮類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定和表征。

圖3 黃酮類主要成分的MS/MS圖

3.3三萜萜類化合物鑒定在HESI負離子模式下，峰59、60、61、62、63、64、65、66、67、68和69保留時間分別為35.15、 30.68、32.70、26.89、28.84、30.51、25.78、27.72、32.06 、31.58和35.48 min，其準分子離子峰分別為m/z805.40039、821.39514、821.39569、837.39044、837.39032、837.39014、983.44781、819.38085、807.41583、807.41595和807.41614 [M+H]-，推測元素組成分別為C42H62O15(質量誤差-1.49 ppm)、C42H62O16(質量誤差-1.66 ppm)、C42H62O16(質量誤差-0.99 ppm)、C42H62O17(質量誤差-1.17 ppm)、C42H62O17(質量誤差-1.31 ppm)、C42H64O15(質量誤差-1.53 ppm)、C42H62O17(質量誤差-1.54 ppm)、C48H72O21(質量誤差-1.54 ppm)、C42H60O16(質量誤差-0.01 ppm)、C42H64O15(質量誤差-1.75 ppm)和C42H64O15(質量誤差-1.36 ppm)。這些峰在MS/MS中均出現一個或多個[M-176]-和[M-162]-的碎片離子峰，推測這些峰為含有1個多個葡萄糖醛酸和葡萄糖苷鍵的化合物，且MS/MS中出現m/z469、453、485等甘草次酸類五環三萜母核的碎片離子，如峰60、65在MS/MS均出現m/z469(甘草次酸)的診斷離子(見圖4)，而碎片離子m/z645(峰60)為準分子離子丟失一分子葡萄糖醛酸所形成，碎片離子m/z821、645、469(峰65)為準分子連續離子丟失一分子葡萄糖和2分子葡萄糖醛酸所形成，結合文獻分別鑒定峰60、65為甘草酸(Glycyrrhizic acid)和Licoricesaponin A3[15-16]。同理，基于標準品的裂解規律、高分辨質譜提供的精確分子量、MSn多級碎片信息等，在正離子和負離子模式下共有14種三萜皂苷類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定。

圖4 三萜皂苷類主要成分的MS/MS圖

3.4酚酸類化合物鑒定在HESI負離子模式下，峰72、73、74、75、76、77、78、79、80和81保留時間分別為24.98、7.86、3.33、5.40、10.51、7.29、6.29、3.11、8.50和23.08 min，其準分子離子峰分別為m/z119.05051、151.04002、153.01935、137.02455、165.0921、179.03498、165.05565、167.03482、167.03485和193.05043 [M+H]-，推測元素組成分別為C8H8O(質量誤差2.28 ppm)、C8H8O3(質量誤差-0.31 ppm)、C7H6O4(質量誤差0.11 ppm)、C7H6O3(質量誤差0.96 ppm)、C10H14O2(質量誤差-0.19 ppm)、C9H8O4(質量誤差-0.11ppm)、C9H10O3(質量誤差-0.41 ppm)、C8H8O4(質量誤差-0.96 ppm)、C8H8O4(質量誤差-0.79 ppm)和C10H10O4(質量誤差-1.04 ppm)。對這些峰的MSn多級碎片信息進行歸屬，在正離子和負離子模式下共有14種酚酸類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定。

3.5其它類化合物鑒定在HESI正離子和負離子模式下，共有10種單萜類化合物和3種二萜類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定和表征，如峰89的保留時間為17.56 min，其準分子離子峰均為m/z479.155612[M+H]-，推測其元素組成為C23H28O11(質量誤差-0.56 ppm)。在MS/MS中產生m/z435、357.11844、327.10791、283.08182等碎片離子(見圖5)，其中m/z435是芍藥內酯苷結構中內酯環中酰氧基兩側斷裂，丟失一分子CO2產生的碎片離子，m/z357.11是準分子離子丟失一分子苯甲酸所產生的碎片離子，而m/z327碎片離子則是丟失準分子離子丟失一分子葡萄糖形成的，通過文獻比對，鑒定峰89為芍藥苷[17]。

另外，在HESI正離子和負離子模式下，共有8種香豆素類化合物、4種木脂素類化合物、4種生物堿類化合物和12種其它類化合物在偏痛湯1號中得以被鑒定。

圖5 峰89(芍藥苷)的MS/MS圖

3.6蔓荊子、炙甘草和細辛中特征成分的指認和歸屬

按照上述方法分析蔓荊子單味藥提取物、偏痛湯1號提取物以及偏痛湯1號除去蔓荊子提取物，得到其在正、負離子模式下的總離子流圖(見圖6A)。基于上述研究獲得的126種化學成分，對蔓荊子中特征成分進行指認和歸屬，共鑒定到17種化學成分為蔓荊子特有成分。同理，對炙甘草中特征成分進行指認和歸屬，共鑒定到60種化學成分為炙甘草所特有(見圖6B)；對細辛中特征成分進行指認和歸屬，共鑒定到5種化學成分為細辛所特有(見圖6 C)。

圖6 偏痛湯1號、主要單味藥及其陰性樣品的總離子流圖

4 結論

本研究采用UHPLC-LTQ OrbitrapMS方法對偏痛湯1號提取物中主要化學成分進行了系統研究，并對偏痛湯1號中蔓荊子、甘草和細辛三味中藥的特征性成分進行了指認和歸屬。該方法能夠實現偏痛湯1號中126種化學成分的快速鑒別，可為偏痛湯1號的藥效物質基礎研究、質量控制和化學成分的快速鑒定提供數據參考，亦可為復雜中藥成分的快速定性分析提供借鑒。