電刺激在視網膜退行性疾病治療中的研究進展

于莎莎，湯 欣，趙 云，李永康，趙 健

0引言

2014年世界衛生組織報告全球范圍內有2.45億人處于低視力水平，其中0.39億為盲人。青光眼、年齡相關性黃斑病變(age related macular degeneration，ARMD)、視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)等被列為主要的不可逆性致盲性眼病，臨床上現有的治療方式多為對癥治療，但其對于視網膜神經元的有效保護作用及患者視覺功能的改善或者重建效果則非常有限，因此探索有效的神經保護方式非常必要。近年研究表明，一定電流強度的眼表電刺激能夠改善RP、外傷性視神經病變(traumatic optic neuropathy，TON)、前部缺血性視神經病變、視網膜動脈阻塞和Stargardt病等多種視網膜和視神經疾病患者的視覺功能[1]。這種電刺激對視網膜和視神經的作用基礎可能與1929年Otfrid證明的眼部電刺激能夠激發患者視皮層的神經反應即電誘發視覺反應相關[2]。2004年，Chow等[3]在RP患者視網膜下植入芯片，證明閾上強度的電流刺激能夠激活視網膜更高級神經元，進而改善視覺功能。此外，動物實驗研究也發現電刺激對視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)和感光細胞具有神經保護作用[4-5]。本文旨在總結電刺激治療在視網膜和視神經退行性疾病治療中的應用進展，闡明其可能的作用機制。

1電刺激的方式

眼科研究中常用的電刺激方式有3種：(1)經角膜電刺激(trans-cornea electrical stimulation，TcES)，多見于基礎和臨床研究中，主要是使用DTL和ERG-jet兩種不同的角膜電極進行，基礎研究中也有使用金或銀質的角膜環狀電極；(2)經眼眶重復性交流電刺激(repetitive trans-orbital alternating current stimulation，rtACS)，可用于角膜功能不良或有眼表外傷等情況的患者；(3)經視神經斷端電刺激，主要用于視神經損傷和再生的動物研究中。

2電刺激在眼科研究中的應用

2.1基礎研究動物和細胞研究表明，電刺激的神經保護作用效果與電流強度、刺激頻率、時間、波長、波形、治療次數等相關[6]。所采用的電流強度范圍因刺激方式不同而變化較大，經視神經斷端的有效電刺激強度為100μA，而TcES為50～300μA。

2.1.1感光細胞退行性病變在遺傳性感光細胞退行性變大鼠的治療中，Morimoto等[7]采用20Hz、100μA的TcES，每周1次、持續2～6wk，結果發現TcES能夠延緩感光細胞死亡，改善視網膜功能，外核層厚度增厚，視網膜電圖(electroretinogram，ERG)b波和暗視閾值反映(scotopic threshold response，STR)負向反應幅值均明顯提高。TcES(20Hz，700μA)也能夠提高視紫紅質P347L轉基因兔的ERG暗視反應b波、明視反應a波和b波反應幅值，而且能增加視條紋上外核層的厚度[8]。此外，預防性的TcES(20Hz，200μA，1h，損傷前2h)能夠減少實驗性光損傷導致的大鼠視網膜感光細胞退行性病變中感光細胞凋亡數量，保持外段長度及外核層厚度無明顯變化[9]。為進一步研究電刺激的作用機制，研究者將電刺激應用于細胞培養中。在強光誘導的體外培養感光細胞凋亡模型中，電刺激能夠顯著減少活化小膠質細胞數量，抑制小膠質細胞白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌，同時能夠增加Müller細胞的數量及其所分泌的腦源性神經營養因子(brain-derived growth factor，BDNF)和睫狀營養因子，為感光細胞創造營養環境進而減少光損傷造成的細胞死亡[10]。感光細胞的損傷或死亡使視覺信號無法轉變為電信號進一步傳遞，而電刺激的作用不僅可以較少損傷，改善視功能，同時可以通過調節膠質細胞的活性對其起到保護作用，因此電刺激的作用機制是多因素共同作用的。

2.1.2視神經損傷在成年Wistar大鼠視神經離斷/鉗夾(optic nerve cut/crush，ONC)模型中，Takeshi等經視神經斷端直接給予電刺激，結果在視神經離斷1wk時RGCs的存活率明顯提高(83%vs54%)[5]。進一步研究發現，電刺激治療效果與電流強度相關[11]，當電流強度增加到100μA時，視神經離斷1wk時，RGCs不僅存活率可到達85%，其形態與正常視網膜中的相似[12-13]。視神經損傷或中斷，RGCs來自軸漿運輸的營養因子和上級中樞的信號傳導均中斷，在缺少營養因子和失去中樞調控的情況下，氧化應激損傷增加、膠質細胞活化、炎性因子釋放等均促進RGCs凋亡。Tagami等[14]發現連續性重復TcES(20Hz，100μA，持續12d)能夠增加在距離損傷250μm處的視神經再生軸突數量，同時發現視神經損傷大鼠視網膜胰島素樣生長因子(insulin like growth factor-1，IGF-1)的表達增加。Schatz等的研究亦認為電刺激對視網膜的神經保護作用可能與上調BDNF、IGF-1等多種神經營養因子相關[15]。此外，研究表明電刺激能夠上調體外培養的Müller細胞的245種基因表達，其中包括通過L型電壓依賴性鈣離子通道上調BDNF[16]和IGF-1[17]的表達。電刺激運動神經元胞體能上調BDNF及受體TrkB mRNA的表達[18]。因此電刺激對RGCs的神經保護作用可能與神經營養因子以及受體的表達相關。

2.1.3視網膜血管病變關于急性視網膜缺血動物模型的研究發現，TcES(20Hz，300μA，60min，每2d一次，持續14d)能夠提高損傷后1wk(75%vs62%)和損傷后2wk(60%vs45%)RGCs的存活率；同時TcES能上調視網膜谷氨酰氨合成酶的表達水平[19]。視網膜谷氨酰氨合成酶主要由Müller細胞分泌，參與視網膜興奮性谷氨酸解毒作用。電刺激對視網膜缺血損傷的作用可能與調節Müller細胞谷氨酰氨合成酶的表達水平有關。

2.2臨床研究目前，電刺激的臨床研究主要局限于改善患者視覺功能的病例報告，缺少大樣本、系統性的隨機對照試驗。隨著研究的深入，電刺激的神經保護效果逐漸被證實，其中電刺激多采用閾上強度的電流，刺激頻率為20Hz，強度范圍150μA～1.5mA。

2.2.1視網膜色素變性Schatz等[20]在對24例RP患者的前瞻性隨機分組的臨床研究中發現，每周30min，持續6wk的閾上強度TcES是安全的，且能夠提高或者維持患者大部分的視覺功能，其中視野和ERG暗視反應b波幅值的改善具有統計學差異，分析這種保護作用的機制是多因素共同作用的結果。

2.2.2視神經病變Gall等[21]對1例27歲單側視神經損傷11a的患者采用rtACS(強度<600μA，30～40min/d，持續10d)治療，結果發現視覺誘發電位(visual evoked potential，VEP)可以檢測到N75-P100波且P100潛時延長，相比電刺激之前VEP檢測不到任何反應波；靜態視野的平均閾值增加2.21dB；動態視野邊界增加4°；電腦視野計檢測出患者閾上刺激辨別能力平均值增加14.31%，且在治療結束后仍有增加，治療后1.5a時這種提高仍保持在15.78%；患者的視功能評價問卷分值也明顯升高，且保持穩定1.5a。rtACS電刺激對患者視功能的改善可能與增強視覺傳導通路神經元間的突觸傳遞有關。Fujikado等[22]對非動脈缺血性視神經病變(non-arteritic ischaemic optic neuropathy，NAION)和TON患者的研究(20Hz，600～800μA，30min)趨勢與Gall等[21]的結果一致，但樣本量較小，指導意義有限。Fedorov等[23]對446例視神經損傷患者進行持續10d的rtACS(強度<1 000μA)治療并觀察隨訪，同樣發現電刺激能夠改善患者的視覺功能。2016年一項多中心的隨機對照臨床研究發現，視神經損傷患者在接受每天50min，持續10wk的rtACS治療后視野范圍擴大24%，靜態視野平均閾值增加9.3%[24]。上述研究表明，電刺激對視神經病變患者的視覺功能具有改善作用。

Sergeeva等[25]研究認為，TcES的治療電流是經視網膜和視神經特異性處理后傳導至大腦皮層的，這種傳導方式使電流能夠增強突觸傳遞，強化殘存視覺系統和高級皮層神經元之間的同步性反應，誘導神經元可塑性發生變化。Sabel等[26]研究結果亦支持神經元同步性反應增強的觀點，其發現電刺激在改善患者視覺功能的同時改變了患者腦電圖波譜，電刺激組α波增加，而對照組下降，伴隨δ波升高，分析其可能與電刺激激活并增強了神經網絡中神經元的同步性反應有關。Miyake等[27]在大鼠視神經損傷后立即給予TcES(20Hz，500μA，持續6h)，發現電刺激能夠使視神經損傷后早期降低的視覺誘發電位迅速回升。另有研究發現，電刺激能夠促進神經傳導功能的恢復及神經再生作用[28]，進一步表明電刺激對視神經損傷后患者的視覺功能具有改善作用，這與激活神經元，增加神經元間的同步性反應相關。但由于電刺激的方式不同，患者的病程、病情均不同以及視功能評估方法的差異，限制了電刺激的廣泛應用。此外，電刺激能夠調節大腦血流量，當TcES作用于三叉神經末端時能調節血管神經反射，增加大腦血流量[29]。

2.2.3視網膜血管病變Koichi等對2例視網膜中央動脈阻塞(central retinal artery occlusion，CRAO)(病程分別為15、33mo)和1例視網膜分支動脈阻塞(branch retinal artery occlusion，BRAO)(病程為26mo)患者給予TcES(20Hz，1 100μA，每月1次，持續3mo)，結果發現3例患者視野均改善，其中2例患者視力升高0.2LogMAR，2例患者ERG反應增強[30]。這與Robles-Camarillo等[31]對視力為光感的CRAO患者和Oono等[32]對BRAO患者進行的TcES治療結果趨勢相同。分析其可能的機制與電刺激改善缺血視網膜的血供相關。Kurimoto等[33]對10例正常受試者進行TcES治療后，分別于3、24h檢測到黃斑區和黃斑視盤間血流信號增強。但Naycheva等[15]對12例CRAO患者和1例BRAO患者經DTL(Dawson-Trick-Litzkow，DTL)電極TcES治療(電流強度為能產生光幻視閾值電流強度的150%，20Hz，30min，1次/wk，持續6wk)，結果未發現患者視野、電生理潛時和幅值的明顯變化。分析造成不同結果的原因可能與視網膜缺血損傷的程度和病程有關，但電刺激治療的參數和時程等不同，缺少統一的應用標準以及評估參數，可能是引起研究結果不同的主要原因。

2.2.4黃斑病變Shinoda等[34]研究發現，經眼瞼電刺激治療后ARMD患者的ETDRS視力表視力分值增加，且電刺激對干性ARMD患者的療效優于濕性ARMD患者[35]，電刺激可以提高大部分干性ARMD患者的視覺對比敏感度和視力[36]。此外，電刺激對遺傳性黃斑相關病變也有一定作用[37]。Ozeki等[38]對1例貝斯特氏卵黃狀黃斑營養不良且視功能明顯降低的患者采用TcES(20Hz，30min，閾上電流)治療，1mo后光學相干斷層掃描(OCT)檢查顯示黃斑區結構無明顯變化，但是患者視力從治療前的20/200恢復至20/30。2a后隨訪，患者視力降至20/70。再次TcES治療1mo后，視力又回升到20/30且保持穩定。

3電刺激的作用機制

電刺激的神經保護作用可能是通過多重機制協同作用的結果。(1)電刺激對視網膜神經元的激活去極化作用。Jeffre等研究發現，體外胚胎視網膜移植或多電極陣列模擬產生的生理水平的神經電活動可以促進突觸生長，證明神經元激活和生理性電活動對其存活非常重要[39]。另有研究發現神經元去極化能夠激活L型鈣離子通道，增加鈣離子內流，進一步激活細胞內鈣離子相關蛋白酶，升高細胞內環磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平；同時鈣離子內流還可以激活細胞內的抗凋亡信號通路，這些作用均能夠促進神經元的存活。然而，在視神經損傷中斷后，神經元不能維持正常的生理活性，光或電信號不能向下一級神經元傳遞。外源性閾上強度的電流刺激能夠激活殘存神經元產生神經電活動，增強殘存神經元的同步性反應，并誘導神經元可塑性變化。這種電刺激被動性地增強殘存神經元以及中樞的電活動，改善局部微環境，對促進神經元存活以及視功能的改善具有重要意義。(2)電刺激對視網膜膠質細胞的作用。神經損傷后小膠質細胞活化，IL-1β和TNF-α等炎性介質釋放會加速病變發展。電刺激可以抑制小膠質細胞，同時增加Müller細胞活性、上調神經營養因子及受體表達。(3)電刺激能夠調節大腦和視網膜的血流量。研究證明，電刺激能增加正常受試者黃斑區和黃斑視盤間的血流量。當TcES作用于三叉神經末端時能調節血管神經反射，增加大腦血流量。(4)電刺激對視網膜基因及蛋白表達的影響。在TcES治療1h后，對正常大鼠全基因組分析顯示，電刺激能夠影響490種基因的表達，包括多種與神經保護作用相關的基因[40]。蛋白組學分析顯示，TcES能夠上調25種細胞功能蛋白的表達，包括細胞信號蛋白、神經傳導相關蛋白、代謝蛋白、免疫蛋白和結構蛋白[41]。因此電刺激對于視網膜的神經保護作用是通過激活損傷的視網膜神經元內在存活機制，上調視網膜神經營養因子及其受體的表達，調節視網膜膠質細胞活性，增加視網膜血流，激活并增強由視網膜到視覺中樞神經回路中神經元的同步性反應等多方面作用而實現的。

4總結和展望

電刺激的神經保護作用與電刺激治療參數、疾病種類和病程等密切相關。隨著對電刺激神經保護作用機制的深入探討以及治療參數的不斷優化，電刺激將應用于不同類型視網膜疾病的大樣本隨機對照臨床研究中，這對于進一步研究電刺激治療的臨床應用價值意義重大。眼部電刺激由于費用低、侵入性低，其可作為一種新型的神經保護和重建視覺功能的治療方式，有望為臨床治療視網膜退行性病變提供新的選擇。