乙型肝炎病毒基因分型檢測在臨床抗病毒治療中的重要性

蔣自衛

乙型病毒性肝炎病情遷延，無有效根治手段，隨著發病程度的加深，可發展為肝硬化、肝癌等嚴重器質性病變，目前抗病毒治療是控制其病情進行性擴展的主要治療方法。根據HBV全基因序列異質性≥8%的界限,可將其分為不同的基因型。HBV基因型在乙型肝炎患者的臨床表現、治療預后和藥物突變上都有一定的影響, 現收集了南京市第二醫院自2015年1月至2015年12月的住院和門診HBV患者60例, 進行了HBV B、C型基因分型, 現報告如下。

資料與方法

一、一般資料

60例HBV感染的患者, 其中男性48例, 女性12例, 年齡男20～56歲, 平均年齡36.2歲, 女性16～64歲, 平均年齡42.4 歲。男性病程2個月～19年, 平均6.7年,女性12 d～32年 , 平均8.3年。其中慢性乙型肝炎輕度8例,中度24例, 慢性重型肝炎5例, 乙肝病毒攜帶者1例, 肝硬化8例, 急性肝炎2例。

二、方法

1.主要的實驗儀器和試劑 ABI7300 熒光定量PCR 儀(美國),乙型肝炎病毒基因分型熒光PCR檢測試驗( 寧波瑞星基因技術有限公司) 。

2.標本采集 抽取靜脈血2 mL～3 mL, 取分離血清0.3 mL。

3.基因分型測定 取血清標本及試劑盒內的B型、C型陽性血清、陰性血清各取50 μL,分別加入50 μL核酸提取液, 振蕩10 s, 99 ℃干浴10 min, 13 000 r/min 離心10 min, 保留上清備用。PCR 擴增: B 型、C 型檢測混合液36 μL,0.4 μL酶(Tap+UNG) , 加上清液4 μL。擴增條件: 37 ℃ 2 min,94 ℃ 2 min,然后94 ℃ 10 s, 62 ℃ 40 s, 進行40個循環, 熒光檢測在62 ℃。熒光通道檢測選擇FAM。按試劑說明進行結果分析, 判斷基因型。

4.HBV DNA定量 取待測血清或血漿樣本以及試劑盒中的對照品各100 μL, 分別加到0.5 離心管中: 加入100 μL 提取液1, 振蕩混勻, 13 000 r/min 離心10 min; 吸棄上清; 再加入25 μL 提取液2, 振蕩混勻至沉淀完全溶解, 2 000 r/min離心10 min, 100 ℃干浴或沸水浴10 min; 13 000 r/min 離心10 min, 保留上清備用。反應體系和條件: PCR 反應液37.6 μL, Tap 酶0.4 μL。UNG 0.06 μL, 上清液2 μL, 反應條件: 37 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,然后95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,擴增40個循環。由計算機根據陽性模板的擴增計算出患者的DNA拷貝數。

結 果

HBV基因型檢測結果：60例HBV感染者, 其基因型: B型0例, C型50例, 占83.3 % , B 型、C型均陰性者10例,占16.7%,其中2例急性乙型肝炎均陰性，5例HBV DNA< 1.0×1 000 拷貝/mL。經此法檢測, 2例急性乙型肝炎為陰性, 5例HBV DNA<1 000 拷貝/mL 者抗病毒方案: 干擾素應用時間為9個月, 本次檢測陰性。慢性乙型肝炎且有乙肝家族史者均為C型。鑒于我們僅做B型、C 型檢測, 而未做其他型的檢測, 10例陰性者可考慮HBV含量極低者可能會出現陰性,另一種情況可能為非B型、C型。

討 論

乙型病毒肝炎患者HBV基因分型和臨床抗病毒治療具有一定的相關性，基因分型對乙型病毒性肝炎的抗病毒治療效果有一定影響。經臨床調查發現, 5例陰性患者在治療中使用抗病毒藥物, 比一般規定的療程要長3～6個月。C基因型與50歲以上的肝癌相關, 且更傾向于較重的肝病和較大年齡患者, 在選擇抗病毒治療后, 積極主張延長抗病毒療程3～6個月, 對今后預防肝癌、肝硬化的發生會起到一定作用, 需要我們進一步追蹤隨訪觀察。