竹子內生真菌Fusarium oxysporum次級代謝產物的研究

解飛翔，袁偉鈺，石佩星，位石頭，李寶庫*

(1. 河北大學藥學院，河北保定 071002；2. 河北大學生命科學學院，河北保定 071002)

植物內生真菌能夠產生與宿主相同或相似的活性物質，利用這一特性，從藥用植物內生真菌中挖掘活性代謝產物已成為開發天然藥物的新途徑[1]。竹子具有許多優良的藥用價值，但對其內生真菌的研究還不多見[2]。因此，筆者對竹子內生真菌尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum的次級代謝產物進行了分離純化與鑒定，為尋找天然藥物先導化合物奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1試材該試驗所用菌種為竹子的植物內生真菌Fusariumoxysporum，采集于泰國清邁湄賽村 (Mae Sae Village, Chiang Mai)，編號DDQ-31，保存于河北大學藥物化學與分子診斷重點實驗室菌種庫。

1.2儀器旋轉蒸發儀R-210(BUCHI)；核磁共振儀(BRUKER)；恒溫搖床ZHWY(上海智城分析儀器有限公司)；超凈工作臺ZHJH-C1112C(上海智城分析儀器有限公司)；U3000型高效液相色譜儀(Thermo Fisher)；柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠板(煙臺化學工業研究所)；Sephadex LH-20(GE Healthcare)。

1.3菌種的發酵及代謝產物的提取分離

1.3.1培養基的制備。PDA培養基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 6.5，115 ℃滅菌15 min。大米固體培養基：每瓶80 g大米，加自來水100 mL，浸泡12 h后，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2菌種的發酵。將菌種DDQ-31接種到PDA液體培養基中，于28 ℃恒溫搖床中150 r/min培養5 d，得到2 L種子液。將2 L種子液以5%的接種量接種到大米培養基中(共40 L)，室溫培養45 d，得到固體發酵物。

1.3.3代謝產物的提取分離。將固體發酵物置于萃取桶中，加入1.5倍體積的乙酸乙酯萃取，每隔24 h萃取一次，共萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮得到浸膏89 g。浸膏采用中壓硅膠柱層析(200～300目)進行分離，用石油醚-乙酸乙酯系統(100:0～0:100(V/V))梯度洗脫，經TLC檢測后合并，共得到Fr1～Fr6組分。再經過反復硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠分離、HPLC制備等方法分離得到化合物1～9。

2 結果與分析

該試驗通過對Fusariumoxysporum進行大米發酵培養，并運用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠色譜、制備液相色譜等方法進行分離純化，從該菌的次級代謝產物中分離得到9個化合物，分別是化合物1(15.7 mg)、化合物2(22.5 mg)、化合物3(11.6 mg)、化合物4(18.3 mg)、化合物5(13.8 mg)、化合物6(31.5 mg)、化合物7(52.7 mg)、化合物8(14.7 mg)、化合物9(9.7 mg)?；衔锏慕Y構式見圖1。

圖1 化合物1～9的化合結構式Fig.1 Chemical structures of compounds 1～9

2.1化合物1C10H12O3，硫酸香草醛顯色為粉紅色，ESI-MSm/s181.21[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δH:7.533 (1H, d,J=1.8Hz, H-2), 7.573 (1H, dd,J=8.3, 1.9Hz, H-6), 6.893 (1H, d,J=8.3Hz, H-5), 2.573 (3H, s, H-8), 3.953 (3H, s, H-9), 3.943 (3H, s, H-10)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δC: 196.84 (C-7), 149.02 (C-3), 153.34 (C-4), 130.53 (C-1), 110.13 (C-2), 123.22 (C-6), 109.93 (C-5), 56.13 (C-9), 26.22 (C-8), 56.04 (C-10)。以上數據與文獻[3]中數據一致，確定化合物為1-(3,4-Dimethoxyphenyl)-ethanone。

2.2化合物2C12H13NO2，硫酸香草醛顯色為紫色，ESI-MSm/s204.24[M+H]+，1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δH: 8.081 (1H, s, -NH), 7.332 (1H, d,J=8.1Hz, H-8), 7.621 (1H, d,J=7.8Hz, H-5), 7.192 (1H, t,J=7.5Hz, H-7), 4.172 (2H, q,J=7.1Hz, H-12), 7.151-7.102 (2H, m, H-2, 6), 3.761 (2H, s, H-10), 1.262 (3H, t, J=7.1Hz, H-13)。13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δC:172.24 (C-11), 127.33 (C-2), 136.13 (C-9), 123.04 (C-7), 118.93 (C-4), 122.24 (C-6), 119.62 (C-5), 111.23 (C-8), 60.84 (C-12), 108.63 (C-3), 31.42 (C-10), 14.34 (C-13)。以上數據與文獻[4]中數據一致，確定化合物為吲哚-3-乙酸乙酯。

2.3化合物3C10H9NO2，硫酸香草醛顯色為紫色，ESI-MSm/s176.19[M+H]+，1H-NMR(600 MHz, CD3OD)δH: 7.533 (1H, d,J=7.9Hz), 7.153 (1H, s, H-2), 7.333 (1H, d,J=8.1Hz), 7.093 (1H, t,J=7.5Hz), 3.723 (2H, s), 7.013 (1H, t,J=7.4Hz)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 176.52 (C-11), 128.72 (H-8), 138.03 (C-9), 124.62 (C-2), 119.81 (C-6), 122.43(C-5), 119.52 (C-4), 108.91 (C-3), 112.23 (C-7), 32.03 (C-10)。以上數據與文獻[5]中數據一致，確定該化合物為吲哚-3-乙酸。

2.4化合物4C10H9NO，ESI-MSm/s160.19[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 9.902 (1H, s, H-10), 8.002 (1H, s, H-2), 8.152 (1H, d,J=8.1Hz, H-5), 7.482 (1H, d,J=8.0Hz, H-8), 7.232 (1H, t,J=7.4Hz, H-7), 7.272 (1H, t,J=7.2Hz, H-6)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD),δC: 187.54 (C-10), 139.05 (C-9), 139.73 (C-2), 125.74 (C-8), 122.43 (C-5), 125.04 (C-6), 123.62 (C-4), 113.25 (C-7), 120.14 (C-3)。以上數據與文獻[6]中數據一致，確定化合物為吲哚-3-乙酮。

2.5化合物5C11H11NO2，硫酸香草醛顯色為紫色，ESI-MSm/s190.21[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δH: 8.103 (1H, s, -NH), 7.313 (1H, d,J=8.1Hz, H-8), 7.603 (1H, d,J=7.7Hz, H-5), 7.133 (1H, t,J=7.5Hz, H-6), 7.193 (1H, t,J=7.5Hz, H-7), 7.092 (1H, s, H-2), 3.703 (3H, s, H-12), 3.782 (2H, s, H-10)。13C-NMR (150 MHz，CDCl3)δC: 172.74 (C-11), 127.25 (C-2), 136.23 (C-9), 123.24 (C-7), 119.73 (C-5), 122.24 (C-6), 118.82 (C-4), 111.34 (C-8), 52.05 (C-12), 108.33 (C-3), 31.24 (C-10)。以上數據與文獻[7]中數據一致，確定化合物為吲哚-3-乙酸甲酯。

2.6化合物6C10H12O4，ESI-MSm/s197.21[M+H]+，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 7.032 (2H, d,J=8.4Hz, H-3, 5), 4.302 (2H, dd,J=7.5, 5.1Hz, H-8), 6.692 (2H, d,J=8.4Hz, H-26), 2.942 (1H, dd,J=13.9, 5.1Hz, H-7), 3.672 (3H, s, H-10), 2.822 (1H, dd,J=13.9, 7.6Hz, H-7)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 175.84 (C-9), 131.53 (C-3, 5), 157.24 (C-4), 129.24 (C-1), 73.42 (C-8), 116.03 (C-2, 6), 40.94 (C-7), 52.32 (C-10)。以上數據與文獻[8]中數據一致，確定化合物為 latifolicinin C。

2.7化合物7C45H57N3O9，APCI-MSm/s784[M+H]+，1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δH: 7.221 (4H, m), 5.651 (1H, d,J=9.4Hz), 7.161 (1H, m), 4.821 (1H, d,J=8.6Hz), 3.561 (1H, m), 3.381 (1H, d,J=13.8Hz), 3.471 (2H, s), 3.041 (3H, s), 2.941 (1H, t,J=13.3Hz), 0.821 (3H, d,J=6.1Hz), 1.941 (1H, m), 0.331 (1H, d,J=6.5Hz)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δC: 169.92, 136.41, 169.72, 128.73, 126.71, 128.53, 75.54, 34.62, 56.84,50.23, 31.91, 17.12, 29.73, 18.33。以上數據與文獻[9]中一致，確定化合物為白僵菌素。

2.8化合物8C3H10N4O，APCI-MSm/s117[M-H]-，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 2.562 (6H, s)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 76.31, 29.82。以上數據與文獻[10]中數據一致，確定化合物為1, 3-diamino-1, 3-dimethylurea。

2.9化合物9C4H10O2，1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δH: 3.522 (2H, m), 1.112 (6H, d,J=6.1Hz)。13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δC: 72.71, 18.93。這此數據與化合物2,3-丁二醇的數據一致，確定化合物為2,3-丁二醇。

3 結論

該研究對竹子內生真菌尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum乙酸乙酯提取物進行分離純化，得到9個化合物。結合化合物的理化性質和波譜分析對其結構進行鑒定，分別為4個吲哚衍生物：吲哚-3-乙酸乙酯(2)、吲哚-3-乙酸(3)、吲哚-3-乙酮(4)、吲哚-3-乙酸甲酯(5)；2個苯環衍生物：1-(3, 4-二甲氧基苯基)-乙酮(1)、latifolicinin C(6)；1個環肽類化合物：白僵菌素(7)；1個脲類化合物：1，3-diamino-1,3-dimethylurea(8);1個醇類化合物：2, 3-丁二醇(9)。其中，除化合物3、7、9外，其余化合物均為首次從竹子內生真菌Fusarium oxysporum中分離得到。