益母康顆粒對(duì)小鼠的急性毒性研究

張學(xué)全，闞琦繽，褚秀玲，蘇建青

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000)

益母康顆粒是在經(jīng)典方劑生化湯[1]的基礎(chǔ)上，配伍益母草等多味中藥研制而成的。益母草為唇形科植物，一年生或兩年生，是新鮮或干燥的地上全草，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是常用的中藥材[2]。益母草味辛、微苦、性微寒，歸心、肝、膀胱經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、利水消腫、清熱解毒等功效[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，益母草具有溶栓、抗凝、降脂、降低紅細(xì)胞聚集、降血黏度、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧自由基和減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載等作用[4-5]。益母草在臨床上被用于治療月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后瘀痛、心血管疾病、血液病等[6]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在傳統(tǒng)湯劑生化湯的基礎(chǔ)上，加入益母草等中藥，并制備成方便使用的顆粒劑型。為了評(píng)價(jià)益母康顆粒劑的安全性，根據(jù)中國(guó)獸藥典的規(guī)定和最新發(fā)布的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法的相關(guān)記載[7-8]，筆者進(jìn)行了益母康顆粒灌胃給藥的小鼠急性毒性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及其飼養(yǎng)條件昆明種SPF小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為37009200004391。飼養(yǎng)小鼠的動(dòng)物房室溫通常在22 ℃左右，相對(duì)濕度在50%左右，采用自然光照，小鼠使用專(zhuān)用料喂養(yǎng)。試驗(yàn)前，所有小鼠先隔離飼養(yǎng)3 d，觀察小鼠的健康狀況及精神狀態(tài)，選擇健康小鼠進(jìn)行分組試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)器材與試劑電子天平(型號(hào)LE204E/02，上海梅特勒-托利多儀器有限公司)、自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(型號(hào)GI54TR，致微(廈門(mén))儀器有限公司)、KD-BM生物組織包埋機(jī)、KD型冷凍石蠟切片機(jī)、KD-T型電腦生物組織攤烤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、離心機(jī)、鼠籠(帶有水壺)、小鼠飼料、墊料、100 mL容量瓶若干、一次性注射器、灌喂器、酒精棉球、鑷子、剪刀等實(shí)驗(yàn)室常用解剖用品；甲醛、乙醇、二甲苯、蘇木素、伊紅、石蠟、鹽酸等均為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.3分組與給藥將60只小鼠隨機(jī)分為10組，其中雄性5組，雌性5組，根據(jù)急性毒性指導(dǎo)原則[9]，雌性、雄性各設(shè)置益母康顆粒水溶液5 000、1 667、557和186 mg/kg 4個(gè)給藥組及1個(gè)空白對(duì)照組，空白對(duì)照組用等量蒸餾水代替，并對(duì)小鼠做好標(biāo)記，加以區(qū)分。試驗(yàn)前小鼠禁食12 h，不限制飲水。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)小鼠稱(chēng)重并記錄，根據(jù)小鼠體重灌胃給藥，連續(xù)給藥觀察7 d，在第4天和第7天分別對(duì)小鼠稱(chēng)重，并做好記錄。

1.4臨床癥狀觀察每天觀察試驗(yàn)小鼠的精神、采食、飲水、呼吸、被毛、糞便和運(yùn)動(dòng)等狀況以及是否有死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束后稱(chēng)量飼料，計(jì)算小鼠采食量。

1.5剖解觀察及臟器指數(shù)計(jì)算使用乙醚麻醉，處死并解剖小鼠，觀察小鼠各臟器有無(wú)肉眼可見(jiàn)病理變化，采集小鼠的心、肝、脾、肺、腎，用紙吸干血跡，精確稱(chēng)量各臟器的重量，計(jì)算臟器指數(shù)。按照如下公式計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器重(濕重)/體重×100%。

1.6組織病理學(xué)檢查取高劑量組(Ⅰ)和空白對(duì)照組(CK1)雌性小鼠的新鮮臟器(心、肝、脾、肺、腎)各2塊，修剪后置于10%甲醛溶液中浸泡24 h，放入組織包埋盒中用流水沖洗12 h除去固定液，先后用75%、85%、95%、100%乙醇脫水1 h；置于二甲苯中浸泡透明10 min，將包埋盒置于65 ℃蠟中浸蠟1 h，然后將組織塊包埋，用切片機(jī)切片，然后展片，烤片，再進(jìn)行2次二甲苯脫蠟10 min，先后用100%、95%、85%、75%的乙醇脫二甲苯，自來(lái)水洗5 min，蘇木素浸泡3 min，再水洗5 min，1%鹽酸酒精分色30 s，再水洗5 min，75%、85%乙醇各3 min，伊紅浸泡3 min，最后封片使用顯微鏡觀察并保存圖片。

1.7數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行匯總與計(jì)算分析，數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀觀察臨床觀察結(jié)果顯示，小鼠在給藥后，除了個(gè)別小鼠活動(dòng)減少，出現(xiàn)怠動(dòng)、呼吸加速現(xiàn)象外，其他小鼠均表現(xiàn)正常，表現(xiàn)異常的小鼠1 h后自發(fā)活動(dòng)逐漸增加，2 h后逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)，可能是由于灌胃對(duì)小鼠造成的不適所致。在整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中，小鼠毛色光滑，糞便、尿液、攝食、活動(dòng)均表現(xiàn)正常。小鼠采食量和體重明顯增長(zhǎng)，且7 d內(nèi)無(wú)其他異常狀況發(fā)生。給藥1～7 d,試驗(yàn)小鼠均沒(méi)有出現(xiàn)死亡，全部存活，受試動(dòng)物的LD50大于5 000 mg/kg，說(shuō)明益母康顆粒較為安全。

2.2體重變化雌、雄小鼠體重分開(kāi)統(tǒng)計(jì)。由表1可知，給藥前4個(gè)給藥組和空白對(duì)照組雌、雄小鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。給藥過(guò)程中，各給藥組和空白對(duì)照組雌、雄小鼠體重在給藥后至試驗(yàn)結(jié)束均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而各給藥組與空白對(duì)照組小鼠體重及其增重均無(wú)明顯差異(P>0.05)，各給藥組與空白對(duì)照組小鼠的增重及采食量無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明益母康顆粒對(duì)雌、雄小鼠的體重均無(wú)顯著影響。

表1 益母康顆粒對(duì)小鼠的增重及采食量的影響

2.3解剖和臟器指數(shù)變化解剖結(jié)果顯示，小鼠的臟器形態(tài)和色澤均正常，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎癥現(xiàn)象。這說(shuō)明益母康顆粒沒(méi)有引起小鼠內(nèi)臟肉眼可見(jiàn)的病理變化。由表2可知，各給藥組雌、雄小鼠的臟器重量與對(duì)應(yīng)對(duì)照組相比差異均不顯著(P>0.05)。4個(gè)給藥組雌、雄小鼠的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、肺臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與相應(yīng)對(duì)照組相比差異均不顯著(P>0.05)。

表2 益母康顆粒對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

2.4病理組織學(xué)變化觀察從圖1可以看出，雌性小鼠高劑量(Ⅰ)組肝臟的細(xì)胞形態(tài)完整，肝索清楚，結(jié)構(gòu)正常；雌性小鼠高劑量組(Ⅰ)腎臟的腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)良好；雌性小鼠高劑量組(Ⅰ)脾臟的脾髓結(jié)構(gòu)清楚，淋巴小結(jié)完整；雌性小鼠高劑量組(Ⅰ)肺臟的肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞清晰；雌性小鼠高劑量組(Ⅰ)心臟的心肌細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。由此可見(jiàn)，益母康顆粒對(duì)小鼠的臟器沒(méi)有造成病理組織學(xué)損害。

3 討論

生化湯是胎產(chǎn)類(lèi)疾病的主要方劑。益母草是比較常見(jiàn)的具有活血、化淤功效的中草藥，其生物學(xué)活性較高，能被廣泛應(yīng)用于臨床上，可用于治療多種疾病。兼具二者優(yōu)勢(shì)的益母康顆粒應(yīng)用前景非常廣闊。隨著相關(guān)研究的深入，需要對(duì)新獸藥益母康顆粒進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

注：a.CK1組雌性小鼠心臟；b.Ⅰ 組雌性小鼠心臟；c.CK1組雌性小鼠肝臟；d.Ⅰ 組雌性小鼠肝臟；e.CK1組雌性小鼠脾臟；f.Ⅰ 組雌性小鼠脾臟；g.CK1組雌性小鼠肺臟；h.Ⅰ 組雌性小鼠肺臟；i.CK1組雌性小鼠腎臟；j.Ⅰ 組雌性小鼠腎臟Note：a. Heart of female mice in CK1 group; b. Heart of female mice in I group; c. Liver of female mice in CK1 group; d. Liver of female mice in I group; e. Spleen of female mice in CK1 group; f. Spleen of female mice in I group; g. Lung of female mice in CK1 group; h. Lung of female mice in I group; i. Kidney of female mice in CK1 group; j. Kidney of female mice in I group圖1 益母康顆粒對(duì)小鼠組織學(xué)病理變化的影響(HE染色，100×)Fig.1 Effects of Yimukang granule on the histopathological changes in mice (HE staining，100×)

安全性評(píng)價(jià)的第一步是急性毒性試驗(yàn)，其原理是動(dòng)物一次或24 h內(nèi)多次接觸外源受試物后，觀察急性毒性反應(yīng)及其程度以及中毒死亡的原因及特征，了解受試動(dòng)物毒性反應(yīng)的劑量、反應(yīng)關(guān)系，求出LD50。通過(guò)該試驗(yàn)可了解受試物對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，為今后的相關(guān)研究提供參考。許多中藥制劑的毒性很小，常常無(wú)法測(cè)出其LD50，故而通過(guò)最大耐受量或最大給藥量來(lái)測(cè)定試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)這些中藥制劑的耐受量[10-12]。該試驗(yàn)根據(jù)性別設(shè)置4個(gè)給藥組和1個(gè)空白對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益母康顆粒對(duì)小鼠的狀態(tài)無(wú)明顯影響，且對(duì)小鼠體重、采食量、臟器重量、臟器指數(shù)及病理組織學(xué)無(wú)不良影響，由此可見(jiàn)益母康顆粒對(duì)小鼠的毒性作用很低。該研究可為益母康顆粒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。