誘變劑對蘆筍單倍體染色體加倍的比較

包艷存，李保華，牟 萌，牛曉雪，李 霞

(山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊 261071)

蘆筍學(xué)名石刁柏(AsparagusofficinalisL.)，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，被列為世界“十大名菜”之一，在國際市場上享有“蔬菜之王”的美稱[1-2]。蘆筍為雌雄異株植物，雄株發(fā)莖數(shù)多，產(chǎn)量比雌株高25%左右，其全雄育種已成為國內(nèi)外蘆筍育種研究的熱點[3]。

在自然群體中蘆筍雄株的基因型是Mm，雌株的基因型是mm，通過優(yōu)良雄株進行蘆筍花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株，其基因型為M或m，其中M型的單倍體植株經(jīng)染色體加倍后，可獲得超雄株(MM)，與優(yōu)良雌株(mm)進行雜交，可育成Mm型的全雄性植株[4]。單倍體植株染色體加倍的目的在于獲得遺傳組成同質(zhì)和純合的加倍單倍體，即DH系[5]。通過單倍體植株染色體加倍，可獲得同質(zhì)型雌株(mm)和同質(zhì)型雄株，即超雄株(MM)。應(yīng)用于蘆筍雜交育種中，育成的品種與常規(guī)育種獲得的品種相比，一致性、穩(wěn)定性將大大提高。

秋水仙堿是目前應(yīng)用最為廣泛且加倍效果最好的化學(xué)誘變劑，但秋水仙堿在誘導(dǎo)植物染色體加倍時，需要較高的濃度，而且其易對被處理的植物材料產(chǎn)生毒害作用，對人體也有危害[6-8]。國外研究者認為Oyrazlin、Surflan等試劑能夠替代秋水仙堿作為染色體加倍試劑，植物對于使用μmol/L濃度這種除草劑的反應(yīng)與使用mmol/L濃度秋水仙堿處理后的反應(yīng)類似，且具有毒性低、用量小、加倍率高等特點。

Oryzalin，中文名稱氨磺靈，化學(xué)名3，5-二硝基N4，N4-丙基磺胺。用Oryzalin處理玉米花藥培養(yǎng)獲得的愈傷，能有效增加染色體加倍率。而且Oryzalin可使百合(Lilum)和尼潤(Nerine)種間不育性雜種的染色體加倍[9]。Oryzalin還應(yīng)用于如甜菜、梨、杜鵑花、大蒜、葡萄等其他植物染色體加倍的研究中，而且其在應(yīng)用過程中，需要的濃度也較秋水仙堿低，研究者認為Oryzalin最合適替代傳統(tǒng)染色體加倍試劑。

研究表明，在染色體加倍試驗中，加入二甲基亞礬(DMSO)溶液能提高加倍效率。DMSO雖然本身并不能提高染色體的加倍效果，但其能提高溶液通過植物分生組織的穿透力，從而使染色體加倍試劑更加活躍，從而達到提高加倍效率的目的。朱惠琴等[10]研究表明二甲基亞礬對秋水仙堿的加倍作用有促進作用，4 g/L秋水仙堿+20 g/L(2%)DMSO處理比單獨使用秋水仙堿煙草單倍體的加倍效率提高2倍以上。 目前已有利用秋水仙堿對蘆筍單倍體進行加倍的研究[11]。筆者采用添加DMSO的不同濃度秋水仙堿和Oyrazlin溶液對蘆筍單倍體莖尖進行加倍處理，旨在比較它們的加倍效應(yīng)，以期為蘆筍染色體加倍找到合適的秋水仙堿替代物。

1 材料與方法

1.1試驗材料供試材料為蘆筍“冠軍”品種優(yōu)良雄株的花藥培養(yǎng)單倍體再生植株的莖尖，取自山東省濰坊市蘆筍所植物組織培養(yǎng)實驗室。

1.2主要藥品及試劑的制備主要藥品：秋水仙堿、Oryzalin、二甲基亞礬(DMSO)。Oryzalin儲備溶液的制備：將0.346 3 mg Oryzalin完全溶解在10 mL DMSO內(nèi)后，用DMSO稀釋至100 mL，此儲備溶液的濃度為10-2mol/mL。Oryzalin工作溶液的制備：用去離子水將儲備溶液稀釋至所需濃度。

1.3試驗方法

1.3.1浸泡法。切取 0.2～0.3 cm 單倍體蘆筍離體幼苗莖尖，在25 ℃條件下，分別用濃度為0.05%、0.10%、0.20%的秋水仙堿(添加2%DMSO)浸泡處理7、12、16 h。切取0.2～0.3 cm單倍體蘆筍離體幼苗莖尖，在25 ℃條件下，分別用0.005%、0.010%、0.020%的Oryzalin溶液(添加2%DMSO)浸泡處理7、12、16 h。

處理完畢后用無菌水沖洗3～5遍，吸干水分，接種于1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L 的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每個處理3個重復(fù)，每瓶培養(yǎng)基接20個莖尖。前期先用弱光培養(yǎng)10～15 d，再轉(zhuǎn)換到新培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待植株生根后取根尖檢測。

1.3.2培養(yǎng)基添加法。切取0.2～0.3 cm 單倍體蘆筍離體幼苗莖尖，在25 ℃條件下，將莖尖垂直朝下接種于添加2%DMSO 的MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基中添加秋水仙堿的濃度分別為 0.1%、0.2%、0.5%；培養(yǎng)基中Oryzalin的濃度分別為0.01%、0.02%、0.05%。

每個處理3個重復(fù)，每瓶培養(yǎng)基接20個莖尖。先置于弱光環(huán)境培養(yǎng)5、7、10 d，然后將莖尖取出，用無菌水沖洗干凈，再莖尖朝上正常接種于新的1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待植株生根后取根尖檢測。

1.3.3植株倍性的鑒定。采用根尖壓片法和DNA流式細胞儀檢測法，檢測經(jīng)誘變劑處理后的蘆筍植株染色體數(shù)目，從而判斷其倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1浸泡法的誘導(dǎo)效果由表1可知，采用浸泡法處理單倍體蘆筍莖尖，以秋水仙素的藥害最明顯，處理后的植株生長速度明顯變慢，出現(xiàn)玻璃化或者莖尖失綠的現(xiàn)象，失綠的會逐漸變黃變白，最后死亡(圖1、2)。隨著試劑濃度的增加，植株的存活率隨之下降。而且蘆筍莖尖對秋水仙堿、Oryzalin的敏感度不同，其中使用2%秋水仙堿處理16 h后，植株成活率僅為5%。Oryzalin處理后植株存活率相對較高。在同一試劑、同一濃度下，成活率也會隨著浸泡時間的延長明顯降低，尤其是在高濃度下。

使用0.1%秋水仙堿處理后加倍率最高，達23.3%。而Oryzalin溶液處理的加倍率最高為18.3%。不同濃度秋水仙堿之間加倍效率差異明顯，以0.1%秋水仙堿加倍效率最高，0.2%效率最低。而對于Oryzalin溶液而言，0.010%的加倍效率高，0.005%和0.020%差異不顯著。

用浸泡法誘導(dǎo)，最終還是以用0.1%秋水仙堿浸泡處理莖尖12 h的方案，染色體加倍效率最高，達23.3%。

表1 浸泡法處理單倍體蘆筍的誘導(dǎo)效果

2.2培養(yǎng)基添加法的誘導(dǎo)效果從表2可以看出，利用培養(yǎng)基添加法，以添加秋水仙堿的方案優(yōu)于Oryzalin，其中用0.2%秋水仙堿處理5 d，加倍效率最高，達38.3%，而Oryzalin的加倍效率最高為25%。培養(yǎng)基添加法的誘導(dǎo)效果優(yōu)于浸泡法。

植株成活率與試劑濃度、處理時間均成反比。但染色體加倍頻率不同，當在試劑濃度低的情況下，會隨處理時間的延長而提高；但在高濃度情況下，則隨著時間的延長而降低。低濃度長時間處理和高濃度短時間處理，差異不顯著。

圖1 0.005% Oryzalin處理7 hFig.1 0.005% Oryzalin treatment for 7 h

圖2 0.2%秋水仙堿處理16 hFig.2 0.2% colchicine treatment for 16 h

誘變劑Mutagenic agent處理濃度Treatment concentration∥%處理時間Treatment time h處理數(shù)Treatment number成活數(shù)Survival number成活率 Survival rate%染色體加倍數(shù)Chromosome doubling∥個染色體加倍效率Chromosome doubling efficiency∥%秋水仙堿0.15604575.01016.7Colchicine7603965.01626.710603253.31220.00.25603050.02338.37602643.32033.310602236.71830.00.55602338.31423.37602033.31016.710601626.7915.0Oryzalin0.015605490.0711.77604880.0915.010604270.01016.70.025604373.31525.07603660.01321.710602643.31016.70.055603456.7915.07602846.7813.310602236.7610.0

2.3植株倍性的鑒定單倍體植株的染色體數(shù)為n=10(圖3a)，若經(jīng)處理植株的染色體數(shù)目加倍為2n=20，則認為該植株已成功加倍為二倍體(圖4a)。單倍體和二倍體生根苗見圖3b、圖4b。

圖3 單倍體根尖染色體數(shù)目及生根苗Fig.3 Chromosome number of haploid root tip and rooting seedlings

圖4 二倍體根尖染色體數(shù)目及生根苗Fig.4 Chromosome number of diploid root tip and rooting seedlings

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，在離體培養(yǎng)條件下，用秋水仙堿和Oryzalin溶液處理單倍體蘆筍的莖尖，均可以誘導(dǎo)單倍體蘆筍的染色體加倍。不管是用浸泡法還是培養(yǎng)基添加法，均是秋水仙堿的加倍效率優(yōu)于Oryzalin(其中培養(yǎng)基添加法的誘導(dǎo)效果優(yōu)于浸泡法)。秋水仙堿仍是蘆筍單倍體加倍最有效的誘變劑。

秋水仙堿一直以來是植物多倍體育種的優(yōu)良誘變劑，但其自身存在劇毒性，對被處理的植物材料、試驗操作人員和生態(tài)環(huán)境會造成危害，而且在誘導(dǎo)植物染色體加倍時需要使用較高的濃度。國外研究者認為Oryzalin、Suflan、Trufulan是秋水仙素的有效代用品。這類染色體加倍劑能有效地抑制植物的有絲分裂，達到染色體加倍的效果，且具有毒性低、用量小、加倍率高等特點。Hansen等[7]研究了Trfulan在蕓蔓屬植物染色體加倍上的應(yīng)用；Takanmura等利用surflan對百合進行誘導(dǎo)，獲得了百合多倍體植株；其他研究者將Oryzalin應(yīng)用于甜菜、梨、杜鵑花。

該試驗選用Oryzalin與秋水仙堿進行對比研究，發(fā)現(xiàn)利用2種方法，Oryzalin也均能誘導(dǎo)蘆筍單倍體染色體加倍。其中利用培養(yǎng)基添加法，0.02%Oryzalin培養(yǎng)5 d，染色體加倍效率也能達25%，植株成活率達73.3%。雖然加倍率低于秋水仙堿，但成活率明顯高，這與其低毒性有關(guān)。

用培養(yǎng)基添加法，在0.01%Oryzalin下，隨著處理時間的延長，染色體加倍效率提高。在0.02%、0.05%Oryzalin時，隨著處理時間的延長，染色體加倍效率反而降低。其中當濃度為0.02%，處理時間為5 d時，加倍效率最高，達25%。整體上看，濃度為0.01%與0.05%的加倍效率差異不大。可能Oryzalin適宜的處理濃度為0.01%～0.02%，適宜的處理時間為5～7 d。

雖然該試驗結(jié)果顯示秋水仙堿仍是蘆筍單倍體加倍的最有效誘變劑。但還應(yīng)對用Oryzalin對蘆筍單倍體染色體加倍做進一步研究，如優(yōu)化處理濃度和處理時間，優(yōu)化后期的培養(yǎng)方法等，Oryzalin有望替代秋水仙堿作為誘變劑。