噻蟲嗪對膠凍樣類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的拮抗作用

任 月，蔡濱海，張愛民

(1.河北葉虹時光農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，河北石家莊 050000；2.河北大學生物技術中心，河北保定 071000)

微生物菌劑是指含有一種或多種有效菌經(jīng)過工業(yè)化生產(chǎn)擴繁后加工制成的活菌制劑[1]，從廣義上講，是指含有不定種類的有益菌，具有一定的肥料效應的生物制劑，具有環(huán)保、生態(tài)及應用范圍廣泛等特點。研究表明微生物菌劑在改良土壤、提升地力、提高肥料利用率、降解污染物、凈化和修復土壤、預防植株病蟲害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)以及保護環(huán)境等方面表現(xiàn)出不可替代的作用[2]。其中膠凍樣類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等菌株在農(nóng)業(yè)微生物肥料領域應用較為廣泛。膠凍樣類芽孢桿菌(P.mucilaginous)是一種可以分解土壤中磷、鉀礦物質(zhì)的一類細菌，具有分解土壤中硅酸鹽、鋁酸鹽及云母等礦物質(zhì)，釋放其中的磷、鉀等多種微量元素供作物吸收利用，從而達到提高作物產(chǎn)量的目的。該菌株作為我國生物肥料生產(chǎn)中的一類重要功能菌，在轉(zhuǎn)化利用土壤中礦物質(zhì)元素等資源在國內(nèi)很多微生物肥料生產(chǎn)企業(yè)中得到了廣泛應用，它對生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展、經(jīng)濟農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要的意義[3]。枯草芽孢桿菌(B.subtilis)可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，有效地抑制植物病原菌的侵染[4]。地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)可以抑制其他有害生物的繁殖及對作物的入侵，提高植株抗性，具有一定的增產(chǎn)作用[5]。

噻蟲嗪是一種常見的殺蟲劑，它屬于第 2 代煙堿類高效低毒殺蟲劑，廣泛應用在蔬菜類、瓜果類、煙草、中藥材、苗木花卉等多種作物。它可有效防治各種蚜蟲、葉蟬、飛虱類、粉虱、金龜子幼蟲、馬鈴薯甲蟲、線蟲、地面甲蟲、潛葉蛾等害蟲及對多種類型化學農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的害蟲[6-7]。該藥劑的內(nèi)吸、傳導性很強，施藥后迅速被內(nèi)吸并傳導到植株各部位[8]。在蘭花種植過程中，花農(nóng)往往會施用微生物菌肥，以達到苗木健壯、促進生根開花和服盆等目的，而當蘭花受到介殼蟲、葉螨、蚜蟲等害蟲的危害時，花農(nóng)會選用高效低毒的噻蟲嗪作為噴霧或灌根的殺蟲劑，但目前尚未見此藥劑與微生物菌劑兼容性之間關系的研究報道。

為研究殺蟲劑噻蟲嗪對微生物菌劑功能菌株的影響，確定其最適使用濃度，研究97%噻蟲嗪原藥對微生物菌劑主要功能菌株的拮抗作用，旨在為評價噻蟲嗪的合理使用及與微生物菌劑混合使用提供一定的理論參考依據(jù)，同時為藥肥復合生物制劑的研制提供有力的理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試材料。供試農(nóng)藥：97%噻蟲嗪原藥，由河北德瑞化工有限公司生產(chǎn)。微生物菌劑樣品：河北濱海農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供的蘭花專用微生物菌劑(主要成分膠凍樣類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)。

1.1.2試劑。葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、氯化鐵、瓊脂等試劑均為國產(chǎn)分析純和生化試劑。

1.1.3培養(yǎng)基。1號檢測培養(yǎng)基(膠凍樣類芽孢桿菌)：蔗糖(或綿白糖)5 g/L，Na2HPO42 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO30.1 g/L，F(xiàn)eCl30.1 g/L，瓊脂 20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

2號檢測培養(yǎng)基(枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂17 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

1.2儀器恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)；電子天平(FA1004，上海天平儀器廠)；全自動高壓滅菌鍋(LDZX-70KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；恒溫培養(yǎng)箱(GNP9080，杭州市匯爾儀器有限公司)； 超凈工作臺(VS-1300L-U，濟南博鑫生物技術有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1噻蟲嗪平板的制備。空白對照平板(CK)：不添加噻蟲嗪的1號檢測培養(yǎng)基和2號檢測培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃、30 min高壓滅菌后制備的平板。

噻蟲嗪平板(T)：每100 mL 2號檢測培養(yǎng)基分別加入0.1、0.2、0.3、0.4 g噻蟲嗪，分裝于250 mL三角瓶內(nèi)，121 ℃，30 min高壓滅菌冷卻后倒平板，制成噻蟲嗪濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的噻蟲嗪平板，每個處理設3次重復。每100 mL 1號檢測培養(yǎng)基分別添加0.005、0.050、0.100、0.200 g的噻蟲嗪，同上述 2號檢測培養(yǎng)基制法，制成噻蟲嗪濃度為0.005%、0.050%、0.100%和0.200%的噻蟲嗪平板，每個處理設3次重復。

1.3.2菌懸液制備。稱取樣品10 g(精確到0.01 g)，加入帶玻璃珠的100 mL磷酸鹽緩沖液中，充分搖勻分散后靜置20 min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min充分振蕩1 h，即成母液菌懸液。用無菌移液管分別吸取1mL上述母液菌懸液，加入9 mL磷酸鹽緩沖液中，按1→10進行系列稀釋，分別得到10，102，103，104，…，106倍稀釋的菌懸液(每個稀釋度應更換無菌移液管)，照此方法依次稀釋3個菌株的9份樣品。

1.3.3加樣及培養(yǎng)。在無菌超凈臺上用移液器分別吸取10-6菌懸液0.1 mL，加至預先制備好的1號、2號固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將稀釋的菌懸液均勻地涂于瓊脂表面，重復3次。將接種菌懸液的培養(yǎng)皿倒置于34 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每24 h取出調(diào)查菌落的數(shù)目，直至不再長出新菌落為止。

1.4數(shù)據(jù)分析運用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，在上述條件下對3個菌株共獲得的45組225個試驗的菌落數(shù)量數(shù)據(jù)，計算各組菌落數(shù)量的算數(shù)平均值，抑制率=(對照培養(yǎng)菌株菌落數(shù)量-對峙培養(yǎng)菌株菌落數(shù)量)/對照培養(yǎng)菌株菌落數(shù)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1噻蟲嗪對膠凍樣類芽孢桿菌YH-001的抑菌結(jié)果利用平板對峙法進行抑菌試驗，噻蟲嗪對膠凍樣類芽孢桿菌YH-001的生長有較強的抑制作用，菌落數(shù)量隨著噻蟲嗪濃度的增加而減少。不同濃度噻蟲嗪處理間比對照差異達極顯著水平，重復之間差異不顯著(表1～2，圖1)。由表1可知，在0.050%濃度下對菌落生長影響不大，但是在0.200%的濃度時，完全抑制了菌落的生長，4個處理濃度抑制率分別達到10%、10%、60%和100%。由圖1可以看出，經(jīng)平板對峙培養(yǎng)48 h 后，不同濃度噻蟲嗪培養(yǎng)基上膠凍樣類芽孢桿菌菌株數(shù)量逐漸稀少，3次重復樣品間菌落數(shù)量變化趨勢一致。

表1 噻蟲嗪對膠凍樣類芽孢桿菌YH-001的抑制作用

表2不同濃度處理YH-001的菌落數(shù)差異分析

Table2AnalysisofthenumberofcoloniesofYH-001treatedwithdifferentconcentrations

差異源Difference Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedomF值F valueP值P valueF0.05處理間Dif-ferent treat-ments5 452.0174113.031 14.51E-073.837 853重復間Dif-ferent re-peated27.457 3321.138 490.367 1964.458 970誤差Error96.469 338---總計Total5 575.94314---

2.2噻蟲嗪對枯草芽孢桿菌YH-002的抑菌結(jié)果噻蟲嗪對枯草芽孢桿菌YH-002的生長沒有抑制作用，菌落數(shù)量隨著噻蟲嗪濃度的增加變化不大。不同濃度噻蟲嗪處理間與對照差異顯著，重復之間差異不顯著(表3～4，圖2)。由表3可知，在0.1%、0.2%、0.3%和0.4%濃度下，抑制率分別為0.29%、8.41%、6.67%和8.89%。由圖2可以看出，經(jīng)平板對峙培養(yǎng)48 h 后，不同濃度噻蟲嗪培養(yǎng)基上枯草芽孢桿菌菌株數(shù)量變化不明顯，3次重復樣品間菌落數(shù)量變化趨勢一致。

2.3噻蟲嗪對地衣芽孢桿菌YH-003的抑菌結(jié)果噻蟲嗪對地衣芽孢桿菌YH-003的生長有明顯的抑制作用，菌落數(shù)量隨著噻蟲嗪濃度的增加而逐漸減少。不同濃度噻蟲嗪處理間比對照差異達到極顯著水平，重復之間差異不顯著(表5～6，圖3)。由表5可知，噻蟲嗪在0.1%、0.2%、0.3%和0.4%濃度下，抑制率分別達到2.13%、10.59%、20.21%、30.85%。由圖3可以看出，經(jīng)平板對峙培養(yǎng)48 h 后，地衣芽孢桿菌菌株數(shù)量隨噻蟲嗪濃度的增高而減少，3次重復樣品間菌落數(shù)量變化趨勢一致。

圖1 噻蟲嗪對膠凍樣類芽孢桿菌YH-001的抑制作用Fig.1 Inhibition of different concentrations of thiamethoxam in colonies of P.mucilaginous YH-001

處理Treatment噻蟲嗪濃度Thiamethoxam concentration%菌落數(shù)Colony count∥個ⅠⅡⅢ平均Average抑制率Inhibition rate%CK0367348322345—T10.13443373513440.29T20.23293043163168.41T30.33233113313226.67T40.43392983053148.99

表4不同濃度處理YH-002的菌落數(shù)差異分析

Table4AnalysisofthenumberofcoloniesofYH-002treatedwithdifferentconcentrations

差異源Difference Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedomF值F valueP值P valueF0.05處理間Dif-ferent treat-ments2 845.90543.958 3830.046 4273.837 853重復間Dif-ferent re-peated1 159.87323.226 5470.093 8684.458 970誤差Error1 437.9138---總計Total5 443.69114---

3 討論

由于微生物制劑對全球農(nóng)業(yè)和環(huán)境有重要貢獻，微生物制劑的研究、生產(chǎn)及使用也呈井噴式增長。據(jù)海外研究機構(gòu)近日公布的《全球農(nóng)業(yè)微生物制劑市場報告》，2017 年全球農(nóng)用微生物制劑的銷售額約為30.9億美元，預計到2022年將達到60.1億美元，復合年增長率為14.21%[9]。微生物制劑的市場需求促進了中外學者對其的研究，但微生物制劑在農(nóng)業(yè)領域多數(shù)研究多側(cè)重于防治作物病害的機制原因、生產(chǎn)堆肥和提高產(chǎn)量等方面[10]，對微生物制劑中微生物本身對土壤中農(nóng)藥殘留降解和與化學肥料、農(nóng)藥兼容性等問題還有待深入研究[11]。該試驗從菌種的抗性出發(fā)，探索其與其他植保產(chǎn)品協(xié)同作用的效果，著重研究不同濃度噻蟲嗪對“葉虹時光”3個功能菌株的抑菌影響，總體來看，噻蟲嗪對3種葉虹時光功能菌株的抑制強弱順序為膠凍樣類芽孢桿菌>地衣芽孢桿菌>枯草芽孢桿菌。目前，市場上的殺蟲劑種類繁多，按其有效成分可分為有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯類、煙堿類、甲脒類殺蟲劑等[12]。國內(nèi)外有大量關于殺蟲劑對土壤酶活性及土壤微生物影響的研究[13]，但對微生物肥料的影響研究還鮮見報道。微生物菌劑發(fā)揮效果受溫度、濕度、土壤pH和光照等很多環(huán)境條件的影響，該試驗中噻蟲嗪在田間對微生物菌劑的影響還有待進一步研究。另外，其他影響噻蟲嗪對葉虹時光蘭花專用微生物菌劑3個功能菌株抑菌的因素還有噻蟲嗪復配的藥劑、乳化劑、使用時期等，這些因素的影響也在進一步探討中。因此，噻蟲嗪對3種常用生防菌株的拮抗影響研究可成為篩選經(jīng)濟、高效藥肥復合生物制劑的一部分，具有廣闊的市場前景。

圖2 噻蟲嗪對枯草芽孢桿菌YH-002的抑制作用Fig.2 Inhibition of different concentrations of thiamethoxam in colonies of B.subtilis YH-002

處理Treatment噻蟲嗪濃度Thiamethoxam concentration%菌落數(shù)Colony count∥個ⅠⅡⅢ平均Average抑制率Inhibition rate%CK0102928994-T10.1998790922.13T20.28389848510.59T30.37678727520.21T40.46169666530.85

表6不同濃度處理YH-003的菌落數(shù)差異分析

Table6AnalysisofthenumberofcoloniesofYH-003treatedwithdifferentconcentrations

差異源Difference Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedomF值F valueP值P valueF0.05處理間Dif-ferent treat-ments1 758.326417.296 2700.000 5293.837 853重復間Dif-ferent re-peated41.220.810 5510.478 0364.458 970誤差Error203.318 58---總計Total2 002.84414---

圖3 噻蟲嗪對地衣芽孢桿菌YH-003的抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentrations of thiamethoxam in colonies of B.licheniformis YH-003