永川毛霉型豆豉在發酵過程中菌群動態變化規律

曾濤，羅沈斌，索化夷，2＊

（1.西南大學 食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

豆豉屬于我國的傳統發酵豆制品。豆豉能產生多種功能活性物質［1－4］，具有降血壓［5－7］、抗氧化［8－11］、抗腫瘤等功效［12，13］。重慶永川豆豉屬于毛霉型豆豉，采用開放式制曲，發酵過程有多種微生物的參與。真菌（細菌）菌落的構成和其動態變化是豆豉發酵正向進行的微生物基礎，因此，研究豆豉發酵過程菌群動態變化是非常必要的。目前PCR-DGGE技術已經被廣泛應用于各種豆豉菌群結構的研究中［14－19］。Chen C等［20］采用PCR-DGGE技術對不同品牌、不同產地的成品豆豉的菌群結構進行了研究，發現分別以總狀毛霉、米曲霉和根霉為核心真菌的豆豉；嗜鹽四聯球菌和枯草芽孢桿菌是豆豉中的常見細菌菌株。Chen等［21］也采用PCR-DGGE技術研究了江西稻香園豆豉后發酵階段的細菌和真菌群落的動態變化。嗜熱解淀粉芽孢桿菌、乳酸乳球菌以及枯草芽孢桿菌為優勢細菌菌株；在真菌水平上，米曲霉占絕對優勢，并有多種酵母參與后發酵。Chen等［22］研究發現稻香園豆豉表面和深層發酵的豆豉的菌群結構是不一致的。而目前關于重慶永川豆豉發酵過程中菌落動態變化的研究還比較少見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

制曲階段的曲料：采集于永川豆豉廠，并采集添加了輔料（白酒、食鹽、醪糟）的豆豉曲料，在實驗中進行后發酵取樣；Soil DNA Kit試劑盒、質粒小提試劑盒、2×Taq PCR MasterMix試劑：購于北京索萊寶生物科技有限公司；丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺：于Sigma公司；T4連接試劑盒、Top10感受態細胞以及pLB零背景快速克隆試劑盒：購于北京天根生物有限公司。

1.2 豆豉的制作［23］

永川毛霉型豆豉的工藝流程：

篩選優質黃豆→浸泡→瀝干水→常壓蒸料→冷卻→攤放在簸箕中自然發酵制曲→翻曲→下架→拌料（食鹽含量13～14g／100g、醪糟3g／100g、白酒3g／100g）→入罐后發酵→成品豆豉。

取樣后存放至－80℃冰箱進行保存。樣本編號及對應取樣時間見表1。

表1 實驗樣品及其對應的取樣時間Table1 Experimental samples and their relative sampling time

1.3 豆豉發酵過程中微生物區系的測定方法

1.3.1 不同發酵時期的豆豉樣品的總DNA提取

按照 Omega Soil DNA Kit試劑盒說明書進行提取。

1.3.2 永川毛霉型豆豉細菌16SrDNA V3區的巢式PCR擴增

以DNA為模板，用16SrRNA V3區通用引物［24－26］：338F（5′-ACT CCT CGG GAG GCA GCA G-3′）及518R（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′），以25μL為體系（1μL模板；引物各1μL；12.5μL 2×Taq PCR MasterMix；9.5μL ddH2O），反應程序：94℃預變性5min，94℃變性50s，55 ℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環，72℃延伸5min，進行第1次擴增。以PCR 產物作為模板，用引物338F（5′-ACT CCT CGG GAG GCA GCA G-3′）和 518R（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′），并在引物338F的5′末端加上40bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），以50μL反應體系（2μL模板；引物各2μL；25μL 2×Taq PCR MasterMix；19μL ddH2O），采用降落PCR反應程序，94℃預變性5min，94℃變性30s，65～55℃退火30s（每個循環降低0.5℃），72℃延伸30s，20個循環，94℃30s，55℃30s，72 ℃ 30s，8個循環，72℃延伸7min，進行第2次擴增。

1.3.3 永川毛霉型豆豉細菌18SrDNA的巢式PCR擴增

以DNA 作為模板，用18SrRNA 引物［27］：NS1（F）（5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）及Fung（R）（5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′），以25μL反應體系（1μL模板；引物各1μL；12.5μL 2×Taq PCR MasterMix；9.5μL ddH2O），采用反應程序：94℃預變性5min，94℃變性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環，72℃延伸5min，進行第1次擴增。以PCR產物作為模板，用引物NS1（F）（5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）及Fung（R）＋（5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′），并在引物Fung（R）＋的5′末端加上40bp的GC夾子（CGC CCG CCG CGC GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G），以50μL反應體系（2μL模板；引物2μL；25μL 2×Taq PCR MasterMix；19μL ddH2O），采用降落PCR反應程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，65～55℃退火30s（每個循環降低0.5℃），72℃延伸30s，20個循環，94℃30s，55℃30s，72℃30s，8個循環，72℃延伸7min，進行第2次擴增。

1.4 DGGE水平電泳分析

使用聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1）進行制膠，細菌采用變性梯度為35%～65%，真菌采用變性梯度為20%～50%，進行DGGE電泳分析。在60℃緩沖液條件下，以130V，6h進行電泳檢測。搖床脫色45min后置于紫外光譜檢測儀下觀察DGGE電泳結果。

1.5 PCR-DGGE切膠以及擴增產物進行克隆

切膠回收后，采用天根生化科技有限公司的pLB零背景快速克隆試劑盒說明書進行克隆。

1.6 質粒檢測以及數據分析

待克隆過后的固體平板長出菌落后，挑取單個菌落到加入抗生素的LB液體培養基中，37℃恒溫培養24h。培養結束后再按照北京索萊寶科技有限公司的質粒小提試劑盒說明書提取質粒，提取后放在－20℃冰箱保存，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。電泳檢測合格后送到生工生物工程（上海）有限公司進行常規測序分析，將序列結果和NCBI數據庫進行比對分析。數據采用Excel 2013進行處理。

2 變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析結果

2.1 真菌水平變性梯度凝膠電泳圖譜分析

對各發酵階段的豆豉樣品的真菌巢式PCR擴增樣品進行DGGE電泳分析，可以切出17條明顯的條帶，分別編號為1～17，見圖1。

圖1 不同豆豉樣品中的真菌巢式PCR的DGGE電泳圖譜Fig.1 DGGE electrophoretogram grams of nested PCR of fungi in different fermented soya beans samples

各個條帶DNA樣品經過克隆擴增得到的質粒序列與NCBI數據庫進行比對，共得到14種不同的真菌，見表2。

表2 豆豉發酵過程中真菌鑒定結果Table2 Identification results of fungi during fermentation of fermented soya beans

由圖1可知，永川豆豉制曲階段占主導地位的真菌是總狀毛霉，此外，米曲霉、米根霉、匍枝根霉也輔助發酵。由于輔料的添加以及入罐發酵的缺氧環境，后發酵時期優勢真菌菌株的豐度均下降。總狀毛霉、米根霉等真菌具有產生蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等多種酶系的能力［28］，降解大分子的糖類和蛋白質，促進發酵的正向進行，為后發酵階段的酵母和乳酸菌的生長提供了營養素。因此，后發酵階段有一些耐鹽的酵母參與發酵，如假絲酵母、德巴利氏酵母、釀酒酵母、魯氏接合酵母等。酵母對成品豆豉中芳香物質的產生有重要影響，其生長和脂類、有機酸類形成密切相關。另外，發酵過程出現少量真菌類雜菌，如青霉屬和赤霉屬等。這表明永川毛霉型豆豉的開放式制曲發酵方式有雜菌引入的安全隱患。

2.2 細菌水平變性梯度凝膠電泳圖譜分析

對各發酵階段的豆豉樣品的細菌巢式PCR擴增樣品進行DGGE電泳檢測，有23條明顯條帶，編號為1～23，見圖2。

圖2 不同豆豉樣品中的細菌巢式PCR的DGGE電泳圖譜Fig.2 DGGE electrophoretogram of nested PCR of bacteria in different fermented soya beans samples

經過克隆、測序、比對，共得到23株不同的細菌，具體見表3。

表3 豆豉發酵過程中細菌鑒定結果Table3 Bacterial identification results of fermented soya beans during fermentation

續 表

由圖2可知，整體上后發酵階段細菌群落結構的復雜程度更高一些。在制曲階段，生長旺盛的真菌產生大量酶，降解大豆中大分子的營養素，促進后發酵中乳酸菌類的生長。永川毛霉型豆豉制曲階段占主導優勢的細菌是乳酸乳球菌，由于輔料的添加，其在后發酵階段后期幾乎消失；后發酵階段主要由魏斯氏菌、乳桿菌屬、明串珠菌、枯草芽孢桿菌等共同參與。由于大量的乳酸菌的繁殖，產生的乳酸可以抑制一些雜菌的生長和真菌毒素的產生。另外，隨著發酵的進行，pH下降，酸化是風味形成的重要前提條件?？莶菅挎邨U菌具有產生蛋白酶的能力，可以有效促進發酵的正向進行。另外，后發酵階段還出現了大豆中常見的根瘤菌和慢生根瘤菌。同樣地，豆豉在發酵過程中出現了費格森埃希菌、新鞘脂菌等細菌類雜菌［29］。

3 結論

永川豆豉制曲階段總狀毛霉（M.racemosus）一直占據絕對的優勢，同時還有匍枝根霉（R.stolonifer）、米根霉（R.oryzae）、米曲霉（A.oryzae）等常見工業真菌輔助發酵。后發酵階段有假絲酵母（Candida）、釀酒酵母（S.cerevisiae）、魯 氏 接 合 酵 母 （Zygosaccharomyces rouxii）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）多種酵母參與發酵。參與后發酵的酵母種類和稻香園豆豉菌群研究結果基本一致。在細菌水平上，制曲階段乳酸乳球菌（L.lactis）占優勢，而拌料后急劇減少，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）等耐鹽性強的菌株成為優勢菌株。永川豆豉鮮香味美、入口即化的優良品質是由整個發酵期真菌菌落和細菌群落共同的協作結果。發酵過程中也出現了青霉（Penicillium）、費格森埃希菌（Escherichia fergusonii）、新鞘脂菌（Novo sphingobium）等雜菌，說明可能是原料或者環境中的雜菌被攜帶進入發酵過程。