枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)抗生素耐受性的研究

高娟娟，賈麗艷＊，田宇敏，郭晉田，甄曉君，郝林

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西潞城市圣堂食品有限公司，山西 潞城 047500）

益生菌作為一類能夠?qū)λ拗魃砉δ墚a(chǎn)生有益作用的活性微生物，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥以及畜牧領(lǐng)域［1］。益生菌的主要來源是動(dòng)物腸道中正常的生理性細(xì)菌和非腸道細(xì)菌［2］。益生菌在人和動(dòng)物腸道內(nèi)，通過棲生、偏生、競(jìng)爭(zhēng)或吞噬等復(fù)雜關(guān)系，改善宿主腸道微生物菌群的平衡進(jìn)而促進(jìn)食物有益代謝，提高免疫力，防治代謝性疾病，且具有綠色安全、無毒副作用、無殘留等特點(diǎn)，作為抗生素的替代品被廣泛應(yīng)用［3－6］。不同的益生菌具有不同的功能，開發(fā)多種性能的益生菌是目前的一種研究趨勢(shì)。

枯草芽孢桿菌CGMCC 6624是本課題組從山西醋醅中分離篩選的1株具有產(chǎn)綠色生物防腐劑細(xì)菌素的菌株［7，8］，且該菌株具有良好的生物學(xué)特性，對(duì)溫度、酒精、氯化鈉、膽鹽、酸堿、表面活性劑和模擬人工胃液和腸液具有一定的耐受性，具有作為益生菌的開發(fā)潛力，但是由于目前益生菌在應(yīng)用過程中容易受到抗生素的影響，對(duì)益生菌的功能產(chǎn)生影響。為此本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，研究枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)抗生素的耐受性，以期為該菌株作為益生菌在食品、飼料中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌CGMCC 6624：由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 抗生素

β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林、青霉素、氨芐青霉素；氨基糖苷類：慶大霉素、新霉素、鏈霉素；四環(huán)素類：四環(huán)素、土霉素；酰胺醇類：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、阿奇霉素；喹諾酮類：氧氟沙星；硝基咪唑類：甲硝唑、替硝唑；磺胺類：磺胺，均為市購。

1.1.3 儀器

Eppendorf Centrifuge 5417R高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；GZX-GF101-3-BS-II／H 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；HPX-9272MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器、SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZWYR-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)液［9］：葡萄糖1g，酵母浸膏1g，蒸餾水100mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［10］：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，瓊脂1.5g，蒸餾水100mL，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 抗生素溶液的配制

將1g抗生素溶于10mL的無菌水或無水乙醇中，配成0.1g／mL的原液。采用倍比稀釋法使其終濃度為10，1，1×10－1，1×10－2，1×10－3，1×10－4，1×10－5，1×10－6mg／mL。

1.2.2 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)抗生素耐受性的測(cè)定

采用雙層牛津杯法［11］，將已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加熱至完全融化，倒入培養(yǎng)皿中，每皿大約20mL，待其凝固；將融化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，混入0.2mL最佳指示菌濃度為1×106cfu／mL的枯草芽孢桿菌CGMCC 6624，混勻，取5mL加到已凝固的培養(yǎng)基上；將培養(yǎng)皿半敞口，靜置于超凈臺(tái)上，待其凝固40min后，在培養(yǎng)基表面垂直放上已滅菌的牛津杯（內(nèi)徑6mm、外徑8mm），輕輕按壓，使其與培養(yǎng)基沒有空隙。將抗生素溶液（5000r／min，5min）取200μL于牛津杯內(nèi)，4℃靜置12h后，30℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈的大小，以上試驗(yàn)均平行3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和Origin 8.5軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐受性

圖1 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)氨基糖苷類的耐受性Fig.1 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to aminoglycosides

由圖1可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)氨基糖苷類抗生素具有不同的耐受性。當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－2mg／mL時(shí)，只有鏈霉素出現(xiàn)抑菌圈，抑菌圈直徑為9.34mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，鏈霉素的抑菌圈直徑最大，為10.21mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，慶大霉素的抑菌圈直徑最大，為13.01mm。氨基糖苷類抗生素主要是影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的過程，妨礙初始復(fù)合物的合成，誘導(dǎo)細(xì)菌合成錯(cuò)誤蛋白以及阻抑已合成蛋白的釋放，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。主要對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的殺菌作用，抗菌效果明顯［12］。但革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)氨基糖苷類抗生素具有一定的耐受性，其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究?？傊莶菅挎邨U菌CGMCC 6624對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)出不同的耐受性，其中對(duì)鏈霉素的耐受性最強(qiáng)，對(duì)新霉素的耐受性最弱。

2.2 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐受性

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酯環(huán)的一大類抗生素，主要通過阻斷50S核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，屬于快速抑菌劑，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌性［13］。

圖2 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐受性Fig.2 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to macrolide antibiotics

由圖2可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有不同的耐受性。當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－2，1.0×10－1mg／mL時(shí)，只有紅霉素出現(xiàn)了抑菌圈，直徑分別為11.31，15.2mm；抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，紅霉素的抑菌圈直徑最大，為25.13mm?？傊?，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素表現(xiàn)出不同的耐受性，其中對(duì)紅霉素的耐受性最強(qiáng)，對(duì)阿奇霉素的耐受性最弱。

2.3 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受性

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指在化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，它是現(xiàn)有抗生素中使用最廣泛的，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌性。β－內(nèi)酰胺類抗生素能抑制細(xì)胞壁粘肽合成酶，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解。動(dòng)物無細(xì)胞壁，不受β-內(nèi)酰胺類藥物的影響，因而本類藥具有對(duì)細(xì)菌的選擇性殺菌作用，對(duì)宿主毒性小，具有藥物毒性低、抗菌活性強(qiáng)、臨床治療效果好并且適應(yīng)性廣的優(yōu)點(diǎn)［14］。

圖3 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受性Fig.3 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 toβ-lactam antibiotics

由圖3可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有不同的耐受性。當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－2mg／mL時(shí)，阿莫西林的抑菌圈直徑最大，為11.18mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，阿莫西林的抑菌圈直徑最大，為19.18mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，阿莫西林的抑菌圈直徑最大，為23.10mm?？傊?，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出不同的耐受性，其中對(duì)青霉素的耐受性最弱，對(duì)阿莫西林的耐受性最強(qiáng)。

2.4 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐受性

圖4 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐受性Fig.4 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to tetracycline antibiotics

四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌性。由于其應(yīng)用方便、抗菌譜廣、品種多、價(jià)格低廉常被應(yīng)用到獸藥和飼料添加劑中。其作用原理是通過阻礙氨酰tRNA與核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合來抑制蛋白合成，進(jìn)而達(dá)到抑菌效果［15，16］。

由圖4可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)四環(huán)素類抗生素具有不同的耐受性。當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－3mg／mL時(shí)，四環(huán)素的抑菌圈直徑最大，為5.01mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－2mg／mL時(shí)，四環(huán)素的抑菌圈直徑最大，為11.18mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，四環(huán)素的抑菌圈直徑最大，為16.19mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，四環(huán)素的抑菌圈直徑最大，為21.06mm。總之，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)四環(huán)素類抗生素表現(xiàn)出不同的耐受性，其中對(duì)土霉素的耐受性最弱，對(duì)四環(huán)素的耐受性最強(qiáng)。

2.5 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)磺胺類抗生素的耐受性

磺胺類抗生素是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，其抗菌譜較廣，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌有抑制作用。磺胺類抗生素由于抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、品種多、使用便利等優(yōu)點(diǎn)被用作動(dòng)物飼養(yǎng)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中［17］。

圖5 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)磺胺類抗生素的耐受性Fig.5 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to sulfonamides antibiotics

由圖5可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)不同濃度的磺胺具有不同的耐受性。當(dāng)磺胺濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，抑菌圈直徑為4.57mm；磺胺濃度為1.0mg／mL時(shí)，抑菌圈直徑為21.17mm。即隨著磺胺濃度升高，抑菌圈直徑也在增大。

2.6 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)喹諾酮類抗生素的耐受性

圖6 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)喹諾酮類抗生素的耐受性Fig.6 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to quinolone antibiotics

由圖6可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)不同濃度的氧氟沙星具有不同的耐受性。當(dāng)氧氟沙星濃度為1.0×10－2mg／mL時(shí)，抑菌圈直徑為9.01mm；當(dāng)氧氟沙星濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，抑菌圈直徑為20.19mm；當(dāng)氧氟沙星濃度為1.0mg／mL時(shí)，抑菌圈直徑為22.03mm。即隨著氧氟沙星濃度升高，抑菌圈直徑也在增大。喹諾酮類抗生素主要是通過抑制菌體內(nèi)DNA旋轉(zhuǎn)酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶IV活性，最終抑制DNA合成而發(fā)揮抗菌作用。喹諾酮類抗生素主要作用于革蘭氏陰性菌，對(duì)革蘭氏陽性菌作用較弱［18］。革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)喹諾酮類抗生素具有一定的耐受性，其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.7 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)酰胺醇類抗生素的耐受性

酰胺醇類主要通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，與細(xì)菌70S核糖體中較大的50S亞基結(jié)合，引起細(xì)菌死亡，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陽性菌，對(duì)沙門氏菌敏感，對(duì)腦膜炎球菌、流感桿菌和淋球菌殺菌作用強(qiáng)［19］。

由圖7可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)酰胺醇類抗生素具有不同的耐受性，當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度為1.0×10－2mg／mL時(shí)，氟苯尼考沒有出現(xiàn)抑菌圈；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，氯霉素的抑菌圈直徑最大，為17.01mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，氯霉素的抑菌圈直徑最大，達(dá)到26.16mm。總之，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)酰胺醇類抗生素表現(xiàn)出不同的耐受性，其中對(duì)氯霉素的耐受性最強(qiáng)，對(duì)氟苯尼考的耐受性最弱。

圖7 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)酰胺醇類抗生素的耐受性Fig.7 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to amide alcohol antibiotics

2.8 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)硝基咪唑類抗生素的耐受性

硝基咪唑類是一種具有5-硝基取代咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，常見的主要有替硝唑和甲硝唑，硝基咪唑類具有抗菌和抗原蟲的作用，同時(shí)也具有抗厭氧菌的作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用于寄生蟲的防治與感染，在無氧或少氧環(huán)境和較低的氧化還原電位下，其硝基易被電子傳遞蛋白還原成具有細(xì)胞毒作用的氨基，抑制細(xì)胞DNA的合成，并使已合成的DNA降價(jià)，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)或阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而使細(xì)胞死亡，發(fā)揮其迅速殺滅厭氧菌、有效控制感染的作用［20］。

圖8 枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)硝基咪唑類抗生素耐受性的研究Fig.8 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to nitroimidazole antibiotics

由圖8可知，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)硝基咪唑類抗生素具有不同的耐受性，當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－5，1.0×10－4，1.0×10－3mg／mL時(shí)，甲硝唑沒有出現(xiàn)抑菌圈，替硝唑的抑菌圈直徑分別為2.01，3.15，4.51mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－2mg／mL時(shí)，甲硝唑的抑菌圈直徑最大，為12.34mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0×10－1mg／mL時(shí)，甲硝唑的抑菌圈直徑最大，為20.14mm；當(dāng)抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，甲硝唑的抑菌圈直徑最大，為24.07mm。總之，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)硝基咪唑類抗生素表現(xiàn)出不同的耐受性，其中對(duì)替硝唑的耐受性最強(qiáng)，對(duì)甲硝唑的耐受性最弱。

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)不同種類的抗生素均具有一定的耐受性。當(dāng)抗生素濃度為1×10－5～1mg／mL時(shí)，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)硝基咪唑類中的替硝唑產(chǎn)生耐受性；當(dāng)抗生素濃度為1×10－3～1mg／mL時(shí)，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)四環(huán)素類中的四環(huán)素和土霉素，喹諾酮類中氧氟沙星產(chǎn)生耐受性；當(dāng)抗生素濃度為1×10－2～1mg／mL時(shí)，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)β-內(nèi)酰胺類中的阿莫西林、青霉素和氨芐青霉素，氨基糖苷類中的鏈霉素，酰胺醇類中的氯霉素、甲砜霉素，大環(huán)內(nèi)酯類中的紅霉素和硝基咪唑類中的甲硝唑均產(chǎn)生一定耐受性；當(dāng)抗生素濃度在1×10－1～1mg／mL時(shí)，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)氨基糖苷類中的慶大霉素、新霉素，酰胺類中的氟苯尼考和磺胺類中的磺胺產(chǎn)生耐受性；當(dāng)抗生素濃度為1.0mg／mL時(shí)，枯草芽孢桿菌CGMCC 6624對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類中的阿奇霉素產(chǎn)生耐受性。以上研究為枯草芽孢桿菌CGMCC 6624作為益生菌在食品及飼料中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。