酶法輔助提取甘蔗渣中水溶性多糖的工藝優(yōu)化

吳金松，陳光靜，馬志偉，陳曉培，劉俊桃，楊新玲，王保營(yíng)*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046；2.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

甘蔗(Saccharumofficinarum)屬草本植物禾本科，有薯蔗、糖桿、甜棒兒等別稱，甘蔗稈直立高3～5 m，根狀莖粗壯發(fā)達(dá)且多汁，是一年生或多年生的草本植物，普遍分布在熱帶和亞熱帶地域，在我國(guó)主要分布的兩廣、貴州等南方地區(qū)[1]。甘蔗中富含多種糖類、蛋白質(zhì)、維生素(B1，B2，B6)、蔗脂、鈣、磷、鐵、植物甾醇、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分。由于甘蔗是生產(chǎn)食糖的主要原料，每年的制糖工業(yè)會(huì)產(chǎn)生大量的甘蔗廢渣，如處理不當(dāng)不但會(huì)引起資源浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染。甘蔗渣中富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及多糖、酚類等活性成分，其目前用途主要在燃料、造紙工業(yè)、木材、糖發(fā)酵、飼料、微生物培養(yǎng)基等方面，而關(guān)于甘蔗渣中活性多糖的提取純化、活性研究報(bào)道較少[2-6]。趙毅[7]發(fā)現(xiàn)從甘蔗渣中以及制糖中提取出的糖蜜里，含有對(duì)小鼠艾氏癌和肉瘤-180有抑制作用的活性多糖物質(zhì)。因此，探究甘蔗渣中的水溶性多糖提取工藝對(duì)于甘蔗渣資源的再利用具有重要意義。

活性多糖的分離提取工藝通常包括酸堿水解法、溶劑提取法、酶解法以及物理強(qiáng)化輔助提取法(超聲波、微波輔助提取)等[8，9]。翁艷英等[10]在微波作用下對(duì)甘蔗渣粗多糖的提取進(jìn)行探究，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳的工藝條件，提取率為0.713%，相對(duì)較低；陳興興等[11]通過(guò)超聲波提取法對(duì)甘蔗渣多糖的提取工藝進(jìn)行研究，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化研究多糖的提取，超聲波提取法的原理是運(yùn)用超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應(yīng)加快植物中有效成分的溶出，但是極易造成甘蔗渣大分子多糖結(jié)構(gòu)的破壞。本文擬采用3種酶(中性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶)輔助提取甘蔗渣中的粗多糖，從中篩選出最佳的一種酶，然后探索該酶的酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH等因素對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)合極差分析來(lái)確定較優(yōu)的提取工藝條件，為工業(yè)化提取甘蔗渣多糖在功能食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫皮甘蔗：購(gòu)于鄭州市姚橋社區(qū)果蔬批發(fā)市場(chǎng)。

無(wú)水乙醇：新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；葡萄糖標(biāo)品：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：開(kāi)封市盛源化工有限公司； 果膠酶(≥30000 U/g，食品級(jí))：上海士鋒生物科技有限公司；纖維素酶(食品級(jí)，≥18000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術(shù)公司；中性蛋白酶(食品級(jí)，≥18000 U/g)：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B分析天平(感量0.0001 g) 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；BJ-150多功能粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司；Hanon i2可見(jiàn)光分光光度計(jì) 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶法輔助提取甘蔗渣水溶性粗多糖的工藝流程

1.3.1.1 去皮、榨汁(收集甘蔗渣)、烘干、粉碎、過(guò)篩

先將新鮮的紫皮甘蔗刮去外皮(留皮會(huì)影響粉碎效果)，然后榨掉甘蔗汁，收集的甘蔗渣經(jīng)90 ℃水漂燙后放入干燥箱中于60 ℃烘干，再用粉碎機(jī)將其粉碎，并過(guò)60目篩后，放置于密封袋中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 水提

將稱好的甘蔗渣粉按照一定料液比加入燒杯中，放入恒溫水浴鍋中，在不同的酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH條件下浸提，酶解期間要用玻璃棒不斷攪拌，避免甘蔗渣粉粘黏燒杯壁而影響浸提效果。

1.3.1.3 離心分離(或抽濾分離)

水提完成后，將其從水浴鍋中取出冷卻后分離上清液與沉淀物。再在同樣的水提條件下將沉淀物重復(fù)浸提，過(guò)濾后丟棄沉淀物，將2次的上清液歸并在一起。

1.3.1.4 上清液濃縮

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速90 r/min，極限真空度0.1 MPa，55 ℃)或用蒸餾裝置蒸餾濃縮，將上清液濃縮至剩余10～20 mL。

1.3.1.5 醇沉

將濃縮液緩慢加入，按一定比例與預(yù)冷4 ℃的無(wú)水乙醇混合(不同的乙醇終濃度)，然后放置于4 ℃的冰箱中靜止12 h左右，會(huì)有白色物質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)，將沉淀物與上清液抽濾分離，收集沉淀物，將沉淀物置于60 ℃的恒溫干燥箱中干燥。

1.3.2 酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖的單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[12,13]，影響酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖的主要因素有酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、提取次數(shù)和乙醇醇沉濃度等。本試驗(yàn)以酶用量(%)、酶解溫度(℃)、酶解pH和酶解時(shí)間(h)為單因素，探究其對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響。

1.3.2.1 不同酶在不同條件下的較優(yōu)酶解條件

果膠酶的較優(yōu)方案：酶解溫度50 ℃、pH 5.0、時(shí)間40 min。

纖維素酶較優(yōu)方案：酶解溫度50 ℃、pH 5.0、時(shí)間35 min。

中性蛋白酶的較優(yōu)方案：酶解溫度50 ℃、pH 4.5、時(shí)間60 min。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]，通過(guò)試驗(yàn)比較，從上述3種酶中選出提取率較高的1種酶，然后用該酶進(jìn)行下述的單因素試驗(yàn)。

1.3.2.2 不同酶添加量對(duì)甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

通過(guò)改變不同的酶用量(1.0%～5.0%)，在固定條件(溫度50 ℃，pH 5.0，時(shí)間40 min，酶解1次)下，依次試驗(yàn)，最后測(cè)定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.3 不同pH條件對(duì)甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

通過(guò)改變不同的pH值(4.6～5.4)，在固定條件(酶添加量3%,溫度50 ℃，時(shí)間40 min，酶解1次)下，依次試驗(yàn)，最后測(cè)定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.4 不同酶解溫度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

通過(guò)改變不同的溫度(40～60 ℃)，在固定條件(酶添加量3%，pH值為5.0下，時(shí)間40 min，酶解1次)下，最后測(cè)定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.5 不同酶解時(shí)間對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

通過(guò)改變不同的酶解時(shí)間(20～60 min)，在固定條件(酶添加量3%，pH值5.0下，溫度50 ℃，酶解1次)下，依次試驗(yàn)，最后測(cè)定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.3 酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖的正交試驗(yàn)優(yōu)化

為了確定酶法輔助提取甘蔗渣中粗多糖的最佳工藝條件，綜合分析提取過(guò)程中各單因素對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率影響的試驗(yàn)結(jié)果，固定酶解次數(shù)為1次，以酶用量(%)、酶解溫度(℃)、以酶解pH和酶解時(shí)間(min)為正交試驗(yàn)考察的4個(gè)單因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)。試驗(yàn)具體安排和不同因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.3.4 甘蔗渣粗多糖提取率的測(cè)定

1.3.4.1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法[15-19]。

取10 g左右的葡萄糖放置于105 ℃的干燥箱中烘至恒重，在干燥器中冷卻后準(zhǔn)確稱量0.100 g，用蒸餾水溶解后定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成葡萄糖儲(chǔ)備液(濃度為1.0 mg/mL)，從儲(chǔ)備液中精確吸取5 mL于50 mL的容量棕色瓶中，加蒸餾水至定容刻度線，得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖供試液。再配制濃度為5%的無(wú)水苯酚溶液，用移液管精確移取50 mL苯酚溶液到1000 mL容量瓶中定容至刻度線，放入棕色瓶中避光保存?zhèn)溆谩浜脻崈簟⒏稍锏脑嚬埽靡埔汗芊謩e準(zhǔn)確移取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的0.1 mg/mL供試液至試管中，按順序加入蒸餾水使總體積達(dá)到1.0 mL。再加入1 mL的5%苯酚溶液充分混勻后，迅速加入5 mL的濃硫酸，立即震蕩混勻(做3組平行)，靜止30 min。以空白試液(1 mL蒸餾水+1 mL 苯酚+5 mL濃硫酸)為參比，用可見(jiàn)光光度計(jì)于室溫下測(cè)定490 nm處的吸光值。根據(jù)所測(cè)溶液的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制回歸方程，進(jìn)而計(jì)算出多糖水解液中的總糖含量(μg/mL)。

1.3.4.2 酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖提取率

將抽提干燥過(guò)的甘蔗渣粗多糖沉淀物用蒸餾水溶解到250 mL容量瓶中，定容到標(biāo)線后搖勻。然后用移液管分別精確吸取2 mL溶液，定容至50 mL的容量瓶中倒轉(zhuǎn)晃動(dòng)，使溶液混合均勻。然后從中量取1 mL甘蔗渣粗多糖溶液，依次加入1 mL的5%苯酚溶液混勻，迅速加入5 mL的濃硫酸，搖勻后靜止30 min。以空白試液做參比，用可見(jiàn)光光度計(jì)于室溫下測(cè)定490 nm處的吸光值。參照總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方程，將吸光度值代入線性回歸方程可計(jì)算出甘蔗渣粗多糖的濃度C。甘蔗渣粗多糖提取率的計(jì)算公式如下：

式中：C為樣品葡萄糖濃度(μg/mL)；V為甘蔗渣粗多糖溶液總體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；M為甘蔗粉質(zhì)量(g)。

1.3.5 甘蔗渣粗多糖的紫外全波段掃描

取干燥后的甘蔗渣粗多糖，配制成0.5 mg/mL的粗多糖溶液，于紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行全波段掃描(190～400 nm)[20]。

1.3.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法

使用Origin 8.7和Excel進(jìn)行圖表的繪制，正交軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗渣粗多糖總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 甘蔗渣粗多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of bagasse polysaccharides

按照葡萄糖濃度和測(cè)得的吸光度計(jì)算出線性回歸方程為y=0.0093x+0.0149, R2=0.9995，總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.2 不同酶對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖2 不同酶提取甘蔗渣粗多糖提取率Fig.2 The extraction rate of crude polysaccharides from bagasse with different enzymes

由圖2可知，在推薦的較佳酶解條件下，纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶3種酶的提取率分別為0.877%，0.987%，0.843%，其中果膠酶的提取率最高，所以選擇果膠酶進(jìn)行后續(xù)的單因素和優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 單因素試驗(yàn)對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

2.3.1 不同酶添加量對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖3 不同酶添加量對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different enzyme additive amount on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖3可知，隨著酶添加量的不斷增加(1%～5%)，甘蔗渣粗多糖的提取率先增加后減小，在酶添加量為3%時(shí)提取率最高，酶的添加量過(guò)大會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)，同時(shí)為后續(xù)的脫蛋白工藝增加難度，因此正交試驗(yàn)選擇酶加量為2%～4% 三水平優(yōu)化為宜。

2.3.2 不同酶解pH對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解pH值的增大(pH 4.6～5.4),甘蔗渣粗多糖的提取率先增大后減小，在pH 5.0時(shí)達(dá)到最大，可見(jiàn)果膠酶在pH 5.0時(shí)具有較高的活性，所以選擇果膠酶pH 4.8～5.2 三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化為宜。

圖4 不同酶解pH對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of different enzymatic pH on extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

2.3.3 不同酶解溫度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖5 不同酶解溫度對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.5 Effect of enzymatic temperature on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖5可知，隨著酶解溫度的不斷升高，甘蔗渣粗多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，50 ℃左右時(shí)提取率達(dá)到最大，由此可見(jiàn)一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，酶分子的活化能增加，從而加速反應(yīng)。此外，蛋白酶也是蛋白質(zhì)的一種，在高于最適溫度的條件下會(huì)發(fā)生變性，因此溫度對(duì)蛋白酶存在著激活與失活 。因此，選擇果膠酶酶解溫度45～55 ℃三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化為宜。

2.3.4 不同酶解時(shí)間對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖6 不同酶解時(shí)間對(duì)甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.6 Effect of different enzymatic time on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖6可知，隨著酶解時(shí)間的增加，甘蔗渣中粗多糖的提取率不斷增加，在20～40 min內(nèi)提取率顯著增加，在40～60 min內(nèi)提取率增加不顯著，考慮到提取效率，選擇30～50 min進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.4 酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)優(yōu)化酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖的試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，通過(guò)極差和極差分析(見(jiàn)表3)可知，4個(gè)單因素對(duì)結(jié)果的影響程度為B>D>A>C，即影響要素的主次關(guān)系排序?yàn)椋好附鈖H>酶用量>酶解溫度>酶解時(shí)間，酶解時(shí)間對(duì)甘蔗渣粗多糖的影響不顯著，綜合考慮，得出最優(yōu)組合為A2B2C1D3，即最佳酶解輔助提取條件為：酶解溫度50 ℃，酶解pH 5.0，酶用量2.0%，酶解時(shí)間50 min。在此提取條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，甘蔗渣粗多糖的提取率為1.09%±0.011%，比推薦的較佳酶解條件提高了10.4%，達(dá)到了預(yù)期的優(yōu)化效果。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

注：F0.05(2,2)=19。

2.5 酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖的紫外吸收曲線

圖7 甘蔗渣粗多糖紫外掃描圖譜Fig.7 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharides from bagasse

由圖7可知，酶法輔助提取甘蔗渣粗多糖溶液在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)，經(jīng)過(guò)紫外掃描后， 260 nm和280 nm 處均無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明不含或含有極少量的核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)篩選出果膠酶作為甘蔗渣中水溶性粗多糖提取率最高的一種酶，對(duì)酶解條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到酶法輔助提取甘蔗渣中水溶性多糖的最佳工藝條件：酶解溫度50 ℃，酶解pH 5.0，酶用量2.0%，酶解時(shí)間50 min。在此提取條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，甘蔗渣粗多糖的提取率為1.09%±0.011%，比推薦的較佳酶解條件提高了10.4%，達(dá)到了預(yù)期的優(yōu)化效果。通過(guò)對(duì)酶法輔助提取到的甘蔗渣粗多糖溶液進(jìn)行紫外掃描，在260～280 nm 處均無(wú)明顯吸收峰，進(jìn)一步說(shuō)明了該提取工藝條件的可靠性。酶法輔助提取到的甘蔗渣粗多糖有待于進(jìn)一步的純化，為甘蔗渣多糖的活性探究和結(jié)構(gòu)鑒定打了下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。