響應面法優化鷹嘴豆發酵納豆工藝

羅倉學，劉曉宇，張雯

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

鷹嘴豆是一種藥食兩用作物，起源于中東地區和亞洲西部，是世界上種植面積較廣的豆類[1]，在中國主要分布于新疆、甘肅、寧夏和青海等地[2]。鷹嘴豆相較于大豆油脂含量極低，富含人體所需的18種氨基酸、蛋白質、脂肪、粗纖維、維生素及鈣、鐵、鎂等營養成分，具有預防高血壓及動脈粥樣硬化，降低膽固醇及血脂、血糖，利尿以及治療失眠等作用[3-7]。目前，我國已廣泛栽培并將其用作食品原料，但其保健作用的開發還處于研究階段。因此，進行鷹嘴豆產品的開發與研究有著巨大的經濟和生態利用價值。

納豆是大豆蒸煮后接種納豆芽孢桿菌，在一定條件下發酵而成的一種傳統豆類發酵食品。納豆中含有上百種生理活性物質及營養物質，且含有全部的必需氨基酸[8]。納豆具有溶解血栓，預防骨質疏松，抗菌，抗氧化，抗癌，提高蛋白質消化率，調整腸道功能等保健作用[9]。Sumi H等[10]于1987年從納豆中提取出具有溶栓功能的物質并命名為納豆激酶(Nattokinase，NK)，納豆激酶屬于納豆枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶，體內體外實驗均已證明其具有高效的溶栓活性[11]，不僅可以直接溶解交聯狀的血栓，還可以催化血纖維蛋白原轉化成有活性的血纖維蛋白原溶酶，增加體內血栓溶解因子的合成，增強體內血栓的溶解活性[12]。

鷹嘴豆盛產于雪域高原，當地人通過簡單的制粉工藝加工成具有保健作用的粉體食品。目前日本的納豆產品研發處于世界領先水平，我國對納豆發酵技術的掌握仍參差不齊。本研究在預實驗的基礎上篩選了鷹嘴豆作為發酵納豆的原料，旨在通過枯草芽孢桿菌的發酵，從原料出發，以納豆激酶活力為指標進行考核，優化鷹嘴豆的發酵條件，增強鷹嘴豆的保健作用，為鷹嘴豆資源的高價化利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆：來源于新疆；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)：本實驗室篩選并保存；磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、無水氯化鈣：均為分析純，天津市天力化學試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；尿激酶、纖維蛋白原：美國Sigma公司。

斜面培養基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、磷酸二氫鉀0.02%、NaCl 0.5%、CaCl20.02%、瓊脂2%。

種子培養基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、磷酸二氫鉀0.02%、NaCl 0.5%、CaCl20.02%。

1.2 儀器與設備

YXQ-SG46-280S壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司；JA2603B電子天平 上海天美天平儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；MJ-250霉菌培養箱 上海百典儀器設備有限公司；HZQ-QG全溫振蕩器 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；DL-CJ-1N醫用型潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；755B紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；微量移液器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 制備種子液

納豆菌經斜面培養基活化后接種到種子培養基中，于33 ℃，120 r/min震蕩培養12 h。

1.3.2 納豆發酵工藝流程

鷹嘴豆→浸泡→蒸煮→接種→發酵→后熟→納豆。

稱取適量鷹嘴豆清洗干凈，加自來水至料液比為1∶1(V/W)浸泡過夜，于120 ℃蒸煮20 min，冷卻至室溫后接種3%納豆菌，于33 ℃靜置發酵72 h，轉入4 ℃冰箱后熟24 h。

1.3.3 納豆激酶活性測定[13]

尿激酶的標準曲線：配制濃度梯度為5848，2924，1462，731，365.5 IU/mL的尿激酶標準溶液，分別取20 μL上述標準液點樣至纖維蛋白平板上，于37 ℃孵育16 h后，測量形成的透明圈的兩條垂直直徑，計算其面積S=πd2/4。以溶圈面積為橫坐標，以標準尿激酶活力的對數值為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1，得方程y=0.0079x+0.8712，R2=0.9975。

粗酶液的制備：取適量成熟的納豆，加入無菌生理鹽水(1∶1，V/W)，于4 ℃，120 r/min浸提1 h，提取液按4000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。取20 μL粗酶液于纖維蛋白平板上點樣，于37 ℃孵育16 h后，測量溶圈垂直直徑，計算面積，參照尿激酶標準曲線方程計算樣品粗酶液酶活。

圖1 納豆激酶活性標準曲線Fig.1 Standard curve of nattokinase activity

1.4 單因素實驗

1.4.1 接種量對NK活性的影響

分別取30 g鷹嘴豆進行清洗浸泡處理后發酵納豆。蒸煮時間20 min，基質含水量50%，發酵溫度33 ℃，發酵時間72 h，后熟時間20 h，以納豆激酶酶活性為指標，研究接種量分別為2%，4%，6%，8%，10%對NK活性的影響。

1.4.2 基質含水量對NK活性的影響

分別取30 g鷹嘴豆進行清洗浸泡處理后發酵納豆。蒸煮時間20 min，接種量3%，發酵溫度33 ℃，發酵時間72 h，后熟時間20 h，以納豆激酶酶活性為指標，研究基質含水量分別為25%，50%，75%，100%，125%對NK活性的影響。

1.4.3 發酵時間對NK活性的影響

分別取30 g鷹嘴豆進行清洗浸泡處理后發酵納豆。蒸煮時間20 min，基質含水量50%，接種量6%，發酵溫度33 ℃，后熟時間24 h，以納豆激酶酶活性為指標，研究發酵時間分別為24，36，48，72，96 h對NK活性的影響。

1.4.4 發酵溫度對NK活性的影響

分別取30 g鷹嘴豆進行清洗浸泡處理后發酵納豆。蒸煮時間20 min，基質含水量50%，接種量6%，發酵時間48 h，后熟時間20 h，以納豆激酶酶活性為指標，研究發酵溫度分別為28，30，32，34，36 ℃對NK活性的影響。

1.4.5 后熟時間對NK活性的影響

分別取30 g鷹嘴豆進行清洗浸泡處理后發酵納豆。蒸煮時間20 min，基質含水量50%，接種量3%，發酵溫度33 ℃，發酵時間72 h，以納豆激酶酶活性為指標，研究后熟時間分別為12，16，20，24，28 h對NK活性的影響。

1.5 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上進行響應面優化實驗時，選取影響較大的3個因素：接種量(因素A)、發酵溫度(因素B)、發酵時間(因素C)，以NK活性為指標，采用Design Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的設計并對所得數據進行分析，確定最佳發酵工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 接種量對NK活性的影響

接種量對NK活性的影響見圖2。

圖2 接種量對NK活性的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on NK activity

由圖2可知，隨著接種量的增大，NK活性呈現先增大再降低的趨勢，這是由于接種量過小時，菌體無法在發酵液內充分生長，難以實現發酵完全；接種量較大，菌種生長繁殖較快，從而有利于產酶。而接種量繼續增加，大于6%時，并沒有遵循以上規律。分析原因，可能是由于接種量過大時，細胞繁殖速度過快，營養成分迅速耗竭，同時細胞快速生長導致初級代謝旺盛，次級代謝被抑制，從而導致NK產量下降。接種量為6%時，細胞生長速率適中，既能實現細胞的大量積累，又能使次級代謝過程順利進行，因此納豆激酶活力達到最大。因此，最佳接種量為6%。

2.1.2 基質含水量對NK活性的影響

基質含水量對NK活性的影響見圖3。

圖3 基質含水量對NK活性的影響Fig.3 Effect of substrate water content on NK activity

由圖3可知，基質含水量對鷹嘴豆發酵后納豆激酶活性有較大影響，當基質含水量達50%時，納豆激酶活力達最高值。基質含水量過小，納豆菌難以充分生長，酶產量下降；基質含水量過大，基質表面則會形成一層液態膜，造成環境供氧不足，不利于納豆菌的生長代謝，導致酶產量較低。因此，最佳基質含水量為50%。

2.1.3 發酵時間對NK活性的影響

發酵時間對NK活性的影響見圖4。

圖4 發酵時間對NK活性的影響Fig.4 Effect of fermentation time on NK activity

由圖4可知，NK酶活性隨發酵時間的延長呈現由低到高再到低的變化趨勢；在發酵24～48 h的過程中，NK酶活呈升高趨勢；發酵時間為48 h時，NK活力達到最高；發酵時間超過48 h后，鷹嘴豆基質中剩余的營養物質不足以維持納豆菌的代謝，同時次級代謝產物中副產物逐漸增多，抑制了NK的生產，從而導致NK活性降低。因此，最佳發酵時間為48 h。

2.1.4 發酵溫度對NK活性的影響

發酵溫度對NK活性的影響見圖5。

圖5 發酵溫度對NK活性的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on NK activity

由圖5可知，隨著發酵溫度的增大，納豆激酶活性先增大后減小，發酵溫度為34 ℃，時納豆激酶活性最高；當發酵溫度大于34 ℃時，鷹嘴豆的活力則逐漸減弱。微生物的生長及代謝過程都需要適宜的溫度，NK的合成反應在最適溫度時，則NK合成過程中的酶活力最高，一旦超過最適溫度，酶的活力就會下降，NK產量會相應降低，NK活力就降低。同時溫度過高會導致納豆色澤暗淡，形態癟軟。因此，最佳發酵溫度為34 ℃。

2.1.5 后熟時間對NK活性的影響

后熟能使納豆在發酵過程中產生的物質進行平衡，同時減少納豆中的不良風味，并使納豆風味變得更加濃郁。后熟時間對NK活性的影響見圖6。

圖6 后熟時間對NK活性的影響Fig.6 Effect of ripening time on NK activity

由圖6可知，隨著后熟時間的增大，納豆激酶的活性呈現先增大后緩慢下降的趨勢，可能是由于隨著后熟時間的延長，產生了特殊的活性物質，抑制了納豆激酶的活性，導致NK活性降低，也可能是納豆激酶發生了轉化或降解作用。因此，后熟的適宜時間選擇20 h。

2.2 響應面優化實驗結果與分析

根據Box-Behnken實驗設計原理，綜合單因素實驗的結果：基質含水量為50%，后熟時間為20 h，選取接種量(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)對納豆激酶活性影響較大的因素作為考察因素，以納豆激酶活性(Y)為評價指標，對鷹嘴豆的發酵工藝條件進行響應面分析，具體實驗方案見表1。獲得多元二次項回歸方程為：Y=977.9+16.06A-4.64B-1.25C+8.55AB+8.46AC+1.95BC-211.31A2-91.63B2-15.43C2。

表1 響應面優化實驗方案及結果Table 1 Design and results of response surface experiments

表2 響應面實驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of response surface experimental results

圖7 發酵溫度、發酵時間和接種量的 交互作用對NK活性影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the effect of fermentation temperature, fermentation time and inoculation amount on NK activity

由圖7可知，發酵溫度和接種量、發酵時間和接種量、發酵時間和發酵溫度之間都有一定的交互作用，最佳預測點在實驗考察范圍內。因此，該二階模型具有良好的擬合度，能真實描述各因素與響應值之間的關系。接種量、發酵溫度、發酵時間與鷹嘴豆納豆的NK活性有顯著的相關性，表現為曲面較陡，其中接種量對鷹嘴豆納豆的NK活性影響最大。結合等高線的疏密程度可知，接種量與發酵溫度的交互作用影響更顯著，接種量與發酵時間、發酵溫度與發酵時間兩兩之間有一定的交互作用，但交互作用的影響不如接種量與發酵溫度的交互作用影響顯著。

根據建立的數學模型進行參數的最優分析，得到鷹嘴豆發酵的最佳工藝條件：接種量為6.04%，發酵溫度為33.98 ℃，發酵時間為47.61 h，模型預測納豆激酶活性為978.274 IU/g。考慮實際操作中的條件限制，將工藝條件調整為接種量6%，發酵溫度34 ℃，發酵時間48 h。為增加可信度，在最佳工藝條件下進行3次平行發酵實驗，得到納豆激酶活性平均值為986.324 IU/g，與理論預測值接近。表明該模型準確可靠，利用該模型在鷹嘴豆納豆生產實踐中是可行的。

3 結論

在單因素實驗結果的基礎上，采用響應面法優化了鷹嘴豆發酵納豆的工藝。以接種量、發酵溫度、發酵時間3個因素作為自變量做3水平3因素的Box-Behnken實驗，得到因素與響應值之間的擬合方程為Y=977.9+16.06A-4.64B-1.25C+8.55AB+8.46AC+1.95BC-211.31A2-91.63B2-15.43C2。獲得鷹嘴豆發酵納豆的最佳工藝參數為：接種量6%，發酵溫度34 ℃，發酵時間48 h，在此條件下納豆激酶活性高達986.324 IU/g，為研發優質納豆食品、提高納豆中的納豆激酶活性提供了實驗數據和技術參考。