間充質干細胞在炎癥及免疫相關疾病中作用機制的研究進展

張國瑞 李曉明 郭雪君

上海交通大學醫學院附屬新華醫院呼吸內科200092

間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是目前研究最廣泛的多能干細胞之一,命名是基于其能夠分化為骨、軟骨及脂肪等中胚層組織的特性。MSC目前并無特異性表型,國際細胞治療學會提出了MSC的鑒定標準,包括貼壁生長、間葉組織分化潛能以及一些表面抗原的表達。除了骨髓,幾乎所有出生后的器官及組織中均存在MSC,包括脂肪、乳牙、外周血、關節軟骨、臍帶血等。到目前為止,骨髓、脂肪組織及臍帶血通常被認為是各項研究的主要來源。MSC不表達人類組織相容性抗原MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子CD80、CD86且能夠在體外大量擴增而不失其免疫調節及分化潛能,這些優勢均使得MSC能夠在組織工程、再生醫學、炎癥及免疫相關性疾病的治療中發揮重要作用。

MSC已被證實在實驗性自身免疫性腦脊髓炎、移植物抗宿主病、支氣管哮喘、COPD、肺纖維化、糖尿病等多種疾病動物模型中起到了改善疾病的作用。大量研究證實,MSC通過旁分泌及細胞間接觸的方式發揮其改善作用。本文就MSC在炎癥及免疫相關性疾病中的作用及機制的研究進展作一綜述。

1 MSC在組織損傷中的分化作用

MSC在多種組織中的廣泛存在以及其多向分化能力使得其在多種臨床疾病模型中存在非常廣闊的前景,盡管MSC缺失特異性的標志以示蹤追尋其向受損部位遷移的方式,我們有理由推測病理條件下嚴重的組織損傷可以動員并募集MSC至損傷部位進行修復。外源性MSC應用時也可歸巢至損傷部位,向特定細胞分化并促進組織再生。MSC通過向多種基質細胞或受損的組織細胞分化,并可以在局部微環境與多種類型的組織細胞及免疫細胞比如內皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等相互作用,促進組織損傷的修復。有研究在豬胰彈性蛋白酶構建的小鼠肺氣腫模型中,體外誘導羊水MSC向肺上皮祖細胞樣細胞分化后氣道注射可以減輕氣道炎癥和纖維化效應,恢復肺泡再生和減少凋亡[1]。實際情況下MSC自發向受損細胞分化是相對罕見的,更多的是通過分泌一系列的生長因子,比如表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管內皮生長因子等,進而影響成纖維細胞和內皮細胞的發育,最終通過細胞外基質與血管促進組織的修復,這可能是MSC促進組織修復的基本機制。組織損傷涉及到多種免疫細胞的參與,但過度的免疫細胞激活則可能反而加重損傷。MSC的低免疫原性及高免疫抑制能力已被證實,在眾多損傷模型中MSC的修復可能部分歸功于其免疫抑制功能。

2 MSC在細胞間接觸時的修復及免疫調節作用

早期研究表明支氣管哮喘發病過程存在上皮細胞線粒體功能障礙,而新證據表明,MSC可以通過細胞間連接比如隧道納米管將線粒體轉移至受損的上皮細胞使其恢復正常功能。研究發現,線粒體Rho-GTP酶Miro1參與調控MSC線粒體至上皮細胞的轉移[2]。該研究通過過表達MSC中的Miro1增強了線粒體的轉移及對上皮損傷的修復能力,而Miro1的敲減則引起相反的結果。在魚藤酮構建的動物氣道炎癥及哮喘模型中,相對普通MSC,過表達Miro1的MSC增強了對氣道炎癥的改善作用,同時逆轉了氣道高反應性及氣道重塑。而在另一體外實驗中,過表達Miro1并沒有改變一氧化氮(nitric oxide,NO)、TGF-β、IL-10以及前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的表達,即未對MSC分泌特性產生影響,但降低了炎癥因子刺激的支氣管上皮細胞分泌的TSLP、IL-25以及IL-33的表達。總的來說,過表達Miro1的MSC通過隧道納米管轉移線粒體改善了上皮細胞的損傷,避免了免疫反應的放大,最終增強了MSC在哮喘模型中的治療效能。

研究顯示,多能干細胞來源的MSC與人氣道平滑肌細胞共培養時可降低煙熏提取物刺激引發的平滑肌細胞線粒體活性氧水平,緩解線粒體膜電位下降以及細胞凋亡。在體則可緩解臭氧暴露構建的COPD模型中線粒體功能障礙,降低氣道高反應性以及減輕氣道炎癥。這些效應至少部分依賴于細胞間接觸的線粒體轉移以及旁分泌調節[3]。

很多研究證實,在MSC介導的免疫調節過程中,促炎細胞因子具有重要作用,MSC在炎癥因子的刺激下產生多種趨化因子及黏附因子,使MSC與免疫細胞密切接觸,在這種條件下MSC可通過分泌多種因子等方式發揮最大的抑制效應。

3 MSC分泌多種因子在免疫調節中的作用

在多項研究中,IL-10、TGF-β、NO、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase,IDO)、腫瘤壞死因子誘導蛋白6(tumor necrosis factor-stimulated gene 6,TSG-6)以及PGE2分別被認為參與介導MSC的免疫抑制作用。有研究通過分離猴、豬、小鼠、大鼠、倉鼠、人、兔的骨髓MSC,體外實驗均驗證了其可發揮免疫抑制作用,通過誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及IDO抑制劑發現骨髓MSC發揮免疫抑制作用的因子依賴于物種。人、猴、豬來源的骨髓MSC利用IDO進行免疫抑制,而小鼠、大鼠、倉鼠、兔來源的骨髓MSC則依賴iNOS表達[4]。

3.1NO NO是一種不穩定的、具有生物活性的、快速擴散的氣體小分子。NO及其衍生的活性氮可以影響多種酶、離子通道和受體。在炎癥因子的刺激下小鼠MSC可上調iNOS的表達,進而調控NO的生成,同時MSC表達CXCL9、CXCL10及CXCL11等多種趨化因子,引起淋巴細胞向MSC的趨化,使NO可以在局部環境抑制淋巴細胞的增殖。NO的不穩定使得其只能在MSC周邊很小的范圍內產生生理作用。因此,在體外MSC與淋巴細胞transwell共培養體系中,NO擴散受限,免疫抑制作用不如細胞直接接觸共培養效應明顯。NO促進T淋巴細胞內信號傳導及轉錄激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5,STAT5)的磷酸化,進而抑制淋巴細胞的增殖,并促進細胞的凋亡。研究發現,T細胞來源的NO抑制CD4+T細胞向Th17分化,NO可以引起Th17特異性轉錄因子RORγ酪氨酸殘基的硝基化,抑制RORγ與IL-17基因啟動子的結合,抑制Th17的分化[5]。iNOS抑制劑或者iNOS基因敲除都能很大程度上逆轉MSC在小鼠移植物抗宿主病模型及遲發型變態反應中的治療效應[6]。

在大鼠胃潰瘍模型中,MSC、NO或者MSC與NO聯合均可通過抗炎、血管生成和抗凋亡的作用對胃潰瘍黏膜病變產生治療作用。在分枝桿菌構建的小鼠膿腫模型中,靜脈注射MSC不僅提高了小鼠的存活率,而且增強了小鼠肺及脾臟的細菌清除。此外,MSC通過增強NO及PGE2的表達以及促進CD4+/CD8+T細胞、高表達CD11b的巨噬細胞和單核細胞向感染的肺臟募集進而治療分枝桿菌感染。

3.2IDO IDO在MSC發揮免疫調節作用中的地位得到越來越多研究的證實,包括抑制T淋巴細胞及自然殺傷細胞的增殖等。IDO是必需氨基酸色氨酸代謝的限速酶,由此導致的局部色氨酸的消耗以及產生的具有免疫調節作用的色氨酸代謝產物被認為有助于IDO表達細胞,包括MSC發揮免疫調節作用。其中犬尿氨酸與犬尿酸(KYNA)是人MSC產生最多的色氨酸代謝產物。研究發現,KYNA可以通過調節炎癥相關基因比如IL-6的表達發揮免疫抑制作用。KYNA可以與MSC芳香烴受體結合后入核,促進靶基因TSG-6的表達,緩解了急性肺損傷模型中性粒細胞浸潤[7]。有研究發現人MSC可劑量依賴性抑制病毒特異性T細胞的增殖。進一步的研究發現,病毒特異性T細胞產生的干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激了人MSC的IDO活性,進而抑制了混合淋巴細胞反應中淋巴細胞的增殖,該抑制作用可被IDO抑制劑1-MT部分逆轉[8]。在異位氣管移植模型中,人脂肪來源的MSC可以通過減少上皮細胞損傷、凋亡及管腔阻塞從而改善閉塞性細支氣管炎,該效應至少部分是通過提高IDO表達進而促進Treg并抑制T細胞浸潤而起作用[9]。

Gonzalo-Gil等[10]在小鼠關節炎模型中給予人MSC后通過上調淋巴結中Treg及Th1細胞比例以及IDO的表達從而緩解了炎癥反應。此外,人MSC可通過上調IDO以及人類白細胞抗原G抑制克羅恩病腸黏膜T淋巴細胞引起的過度的炎癥反應。人MSC同樣可通過分泌大量的IDO抑制系統性紅斑狼瘡患者T淋巴細胞增殖,其中CD8+T細胞分泌的IFN-γ通過IFNGR1/Jak2/STAT信號通路增強了IDO的活性[11]。通過對IFN-γ刺激過的MSC進行流式染色,研究人員發現IDO與PD-L1的表達與MSC對淋巴細胞增殖的抑制功能呈正相關[12]。這些都說明了IDO在人MSC免疫調節功能中的重要作用。

3.3PGE2PGE2是MSC在炎癥因子刺激后產生的另一種免疫抑制分子。已有報道PGE2參與MSC介導的對T淋巴細胞、自然殺傷細胞以及巨噬細胞的抑制。在小鼠炎癥性腸病模型中,腹腔注射貓脂肪MSC可以通過分泌PGE2進而增加Foxp3+Treg的比例來減輕炎癥反應[13]。MSC可抑制na?ve CD4+細胞及記憶性T細胞向Th17分化,同時也能抑制單側輸尿管梗阻模型炎癥部位Th17分泌IL-17A,該效應通過細胞接觸后誘導MSC環氧合酶2的生成,進而分泌PGE2并和前列腺素受體EP4結合而完成[14]。研究發現,促炎型M1巨噬細胞可通過MSC環氧合酶2-PGE2途徑促進成骨分化,這可能為非甾體類抗炎藥對骨折愈合的不良影響提供一種可能的解釋[15]。在小鼠急性肝衰竭模型中,MSC可通過分泌PGE2抑制肝細胞凋亡,還可通過活化YAP使其相關基因表達增加并激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白,協同刺激肝細胞的增殖,最終促進急性肝衰竭的恢復[16]。PGE2是炎癥微環境重要組成部分,其在MSC介導的免疫調節作用中的角色需要進一步研究。在脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠模型中氣道給予臍帶血來源的MSC可以顯著提高生存率并減輕肺部炎癥。蛋白質芯片及生物信息學分析顯示MSC主要通過旁分泌尤其是PGE2的分泌發揮治療作用[17]。

3.4TSG-6 TSG-6是一種廣泛表達的抗炎因子,參與多種炎癥及免疫相關性疾病進程。如前所述,色氨酸代謝產物KYNA促進靶基因TSG-6的表達,緩解了急性肺損傷模型中性粒細胞浸潤。研究發現,在高氧誘導的新生小鼠支氣管肺發育不良模型中,腹腔注射MSC條件培養基及外泌體均可顯著改善肺、心和腦病理,進一步的研究發現外泌體中存在的TSG-6可減輕支氣管肺發育不良及相關疾病,給予相應抗體或者siRNA敲除均逆轉了MSC外泌體的治療作用,這都提示TSG-6在支氣管肺發育不良的治療中發揮重要作用[18]。在小鼠原位肺移植構建的缺血再灌注模型中,靜脈給予MSC提高動脈血的氧合能力,減少肺部炎癥細胞浸潤,降低Toll樣受體4表達,促進TSG-6的生成,使移植肺免受缺血再灌注及細胞凋亡的影響[19]。小鼠炎癥性腸病模型中,MSC通過釋放TSG-6誘導小鼠巨噬細胞表型向抗炎型M2巨噬細胞轉化,減輕了硫酸右旋糖酐鈉誘導的結腸炎[20]。同樣有研究發現在小鼠糖尿病模型中,結膜下注射MSC可通過分泌TSG-6激活角膜上皮干細胞/祖細胞,促進M2巨噬細胞極化,促進了糖尿病小鼠角膜上皮的愈合[21]。在脂多糖誘導的小鼠重癥急性胰腺炎模型中,腹腔注射MSC分泌的TSG-6顯著抑制內質網應激及炎癥反應中的核轉錄因子κB活性,進而改善重癥急性胰腺炎[22]。

3.5IL-10 盡管IL-10被認為參與了MSC介導的免疫調節作用,MSC是否直接分泌IL-10仍需要更多的證據來證明。IL-10轉染的MSC對小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型CD4+T淋巴細胞的增殖具有更明顯的抑制作用,在體則可明顯改善髓鞘化,減少脊髓白質中淋巴細胞浸潤[23]。有報道在IFN-γ和腫瘤壞死因子α刺激下,MSC中糖皮質激素誘導亮氨酸拉鏈蛋白轉移入核,促進激活素A的表達,最終通過激活Smad3/2及增強T淋巴細胞IL-10的生成抑制Th17的分化[24]。體外研究發現MSC可通過IL-10抑制Th17的分化,IL-10抗體或siRNA均可逆轉該現象,其機制可能涉及STAT5的磷酸化以及STAT3與Th17特異性轉錄因子RORγ啟動子結合的減弱[25]。在雞卵清白蛋白構建的小鼠哮喘模型中,尾靜脈給予脂肪MSC上調了肺組織中IL-10水平,促進了Treg的分化,抑制了氣道炎癥及高反應性[26]。

3.6其他因子 除了上述因子,半乳凝素TGF-β、PD-L1、血紅素加氧酶1等因子均被報道參與介導MSC的免疫調節作用,它們在免疫調節作用中的地位以及與其他因子之間的相互關聯仍需要更多的研究。

4 展望

總的來說,在各種動物模型及體外實驗中,多種因子被認為參與了MSC介導的免疫調節作用,這可能取決于MSC來源與具體的作用微環境。而且多種因素可能在其中發揮協同作用。進一步在特定的微環境中明確MSC發揮免疫調節作用的分子機制及各個因子的地位,必將為MSC的臨床應用提供更多的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突