不同貯藏方法對華頂杜鵑花粉活力的影響

李修鵬 ，沈登鋒，徐沁怡，章建紅，何立平，李東賓，余敏芬，沈 波

（1.寧波市林特科技推廣中心，浙江 寧波 315012；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 寧波 315040；3.寧波市林場，浙江 余姚 315440）

華頂杜鵑Rhododendron huadingense 屬杜鵑花科Ericaceae 杜鵑屬Rhododendron，由丁炳揚等在浙江省天臺縣華頂山首次發(fā)現(xiàn)并命名[1]，其株高可達1～4 m，樹皮深縱裂，先花后葉，花大，花冠淡紫色或紫紅色，艷麗，是我國高山杜鵑中極具觀賞和育種價值的物種[2-4]。目前僅在浙江省的天臺華頂山，金華婺城北山，磐安大盤山、高二鄉(xiāng)和寧波的余姚四明山、奉化商量崗、寧海岔路大短柱等地區(qū)有少量發(fā)現(xiàn)，為浙江省特有種[2-4]。因其自然分布區(qū)狹小，種群數(shù)量少，處于瀕危狀態(tài)，已被列為浙江省重點保護野生植物和極小種群保護植物[5-7]。國內(nèi)學者已對華頂杜鵑的群落學特征[5-8]、種子特性[3-4]、遺傳多樣性水平[5,9]等方面進行過研究，試圖從不同角度揭示華頂杜鵑的瀕危原因。

花粉作為植物的雄配子體，是植物種質(zhì)的形式之一，包含著物種的所有基因，具有豐富的遺傳多樣性，是種質(zhì)保存、交換和雜交育種的重要材料[10]，在有性生殖中發(fā)揮著重要的作用，花粉發(fā)育及花粉管的萌發(fā)和生長是植物有性生殖過程中的重要事件[11]，花粉活力和萌芽率是影響受精能否成功以及種子品質(zhì)及其自然更新的最關鍵因素。本文從花粉活力以及不同貯藏方法對花粉活力的影響角度進行了研究，以期為促進華頂杜鵑的種群天然更新、物種保存和種質(zhì)創(chuàng)新利用方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來源于寧波市林場商量崗林區(qū)（寧波市奉化區(qū)境內(nèi)）的華頂杜鵑自然群落植株。母樹高2～4 m，胸徑4～6 cm，冠幅1.5～3.0 m，基部多分枝，散生長于海拔約800 m 的西至西北坡落葉闊葉林中。2017年4月6 日上午，從具有代表性的5 株生長健康、花朵發(fā)育正常的母樹上采集即將開放的花枝，修剪整理后置于盛有清水的水桶中水養(yǎng)，帶回寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院實驗室內(nèi)繼續(xù)水培，待花朵剛開放或即將開放時剪取花藥，收集于墊有硫酸紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，室內(nèi)陰干1～2 d，待花粉自然散出，收集花粉，裝于2 mL 凍存管中，至8 日清晨結(jié)束，之后不再采集[12]。

采用以下4種方法密封貯藏花粉：20℃常溫貯藏；4℃低溫貯藏；－20℃低溫貯藏；－80℃超低溫貯藏。其中，常溫貯藏的花粉于7 日7:00－7:30 收集；其余3種貯藏方法的花粉于7－8 日7:00－7:30 收集，每次采集的花粉均藏于不同的離心管中，共收集了3 管（基于預實驗的結(jié)果和實驗設計，3 管可滿足實驗用量），臨時在4℃低溫下保存，待花粉收集夠后，將3 管花粉進行充分混合后再均分成3 份，用于4℃,－20℃，－80℃ 3種不同溫度的貯藏處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉培養(yǎng) 在參閱相關文獻[11-14]并經(jīng)預實驗的基礎上，確定采用優(yōu)化固體培養(yǎng)基進行花粉培養(yǎng)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：10 g·L-1蔗糖+10 mg·L-1硼酸+0.7%的瓊脂，調(diào)節(jié)pH 值至6.5。在雙孔凹型載玻片孔內(nèi)滴入0.1 mL 的培養(yǎng)基，用毛筆蘸取充分混合后的花粉，均勻撒播于培養(yǎng)基表面。將玻片置于鋪有2 層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

1.2.2 花粉活力測定 在40×顯微鏡（寧波永新XSZ－N107）下觀察統(tǒng)計花粉管萌發(fā)的方法來評價花粉活力，判斷花粉萌發(fā)的依據(jù)是：四合體只要有一個萌發(fā)（即花粉管長度等于或超過花粉粒直徑）則視為花粉已萌發(fā)[12,14]。每個處理分別培養(yǎng)3個玻片，每個玻片取4個視野計數(shù)。所有數(shù)值小數(shù)點后保留一位小數(shù)。萌發(fā)率計算公式為：

萌發(fā)率（%）＝已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/測定的花粉粒總數(shù)×100

不同處理花粉的活力測定時間：①20℃常溫貯藏 4 月7 日開始觀測，每天在8:00 和14:00 觀測兩次，持續(xù)7 d，其中4 月7 日8:00 測定的花粉活力視為花粉的原始活力；②4℃低溫貯藏 貯藏后第7 天（4 月13 日）開始觀測，每2 d 觀測一次，至花粉萌發(fā)率低于20%時停止觀測；③－20℃低溫貯藏 貯藏后第30 天（5 月6日）開始觀測，每10 d 觀測一次，持續(xù)觀測至第120 天；④－80℃超低溫貯藏 貯藏后第60 天（6 月5 日）開始觀測，每10 d 觀測一次，持續(xù)觀測至第120 天。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 計算和分析，利用Sigmaplot 12.0 版專業(yè)繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫貯藏條件下花粉活力的衰變

遠大于種群間變異（1.64%），遺傳分化系數(shù)為0.072 6，遠小于1，表明其種群間分化不明顯，繁殖方式更接近于混交且以異交為主。因此，她推斷導致華頂杜鵑瀕危的原因可能是人為干擾及生境破碎化導致其種群規(guī)模逐漸下降，微生境異質(zhì)性的選擇作用增加了近交的程度，從而引起近交衰退，導致遺傳多樣性的喪失，降低了華頂杜鵑對環(huán)境的適應性[5]。

綜合前人及本研究結(jié)果，我們認為，在華頂杜鵑花粉和種實活力不低的前提下，其群落中更新的幼苗、幼樹很少，說明在種實萌發(fā)至幼苗成活、定居階段可能存在某種障礙，這種障礙可能就是導致其處于瀕危狀態(tài)的主要原因，但其中究竟存在什么樣的障礙尚需作進一步研究。