1型傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及生物學特性

徐引弟 ，王治方 ，張青嫻 ，朱文豪 ，李海利 ，焦文強 ，王克領

（1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南鄭州450002）

傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是引起豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）的病原，是一種豬的高度接觸性傳染性呼吸道疾病，主要表現為暴發性流行，以纖維素性、出血性、壞死性肺炎為特征，發病率在8.5%～100%，死亡率在0.4%～100%，是當前導致育肥豬和種豬呼吸道疾病發病和突然死亡的主要原因，已在世界范圍內造成了巨大的經濟損失[1-5]。

胸膜肺炎放線桿菌血清型多達15種，且目前還有很多不能定型的臨床分離菌株，其流行率因地理區域而異，不同血清的毒力和免疫原性存在差異，國內流行的血清型主要是 1，2，3，5，7 型，APP外毒素在致病與免疫中起著重要作用，APP一共有4種外毒素，即毒素ApxⅠ，ApxⅡ，ApxⅢ和 ApxⅣ，而且毒素ApxⅠ和ApxⅡ在APP毒力方面起著關鍵作用。不同血清型分泌的外毒素不一樣。血清1型能同時分泌毒素ApxⅠ，ApxⅡ和ApxⅣ，是所有血清型毒株中毒力最強、免疫原性最好的毒株，同時也是我國流行的一種優勢血清型毒株[6-10]。因此，APP的分離鑒定和準確的血清分型對于疫情診斷、疫情流行病學調查和該病的防治尤為重要。

本試驗對河南省某規模化豬場突發育肥豬死亡的病例進行了傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定和生物學特性研究，旨在為指導豬場科學及時防控該病、減少損失提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 其來源于河南省汝州市某大型養豬場疑似病例的育肥豬，發病豬高燒、體溫達42℃，口鼻流血，死亡很快，解剖肺臟充血出血嚴重，采集發病豬的肺臟、心血、關節及腦組織等。

1.1.2 主要試劑 動物基因組DNA抽提試劑盒，DL2000 Marker，2×PCR Mix，50×TAE 濃縮液，新生牛血清購自生工生物工程（上海）股份有限公司；TSA（胰蛋白大豆瓊脂）、TSB（胰蛋白大豆肉湯）購自BD公司；NAD（輔酶Ⅰ）購自Roche公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基配制 TSA固體培養基和TSB液體培養基的制備參考文獻[4]進行。

1.2.2 細菌的分離純化 無菌采集病豬的肺臟、心血接種于TSA固體培養基上，37℃恒溫培養箱中培養24 h，挑取圓形凸起、半透明、光滑、濕潤的、側對光線有虹光以及直徑大小為1～2 mm的可疑菌落，革蘭氏染色在油鏡下觀察細菌，挑單菌落純化于TSA培養基上，同時將可疑菌落接種于不含NAD但含血清的TSA固體培養基上，觀察菌落生長情況以及形態大小。

1.2.3 鑒定

1.2.3.1 引物設計 參考文獻[11-12]報道，根據傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIV基因的序列設計1對通用引物P1，P2，用于傳染性胸膜肺炎放線桿菌的擴增；同時根據傳染性胸膜肺炎放線桿菌莢膜CPS1B基因的序列設計1對傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型的特異性引物P3，P4，用于傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型的擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列列于表1。

表1 PCR擴增HPS基因引物序列

1.2.3.2 APP的擴增 PCR反應體系（總體積25μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物 P1，P2各1 μL，模板（按照DNA提取試劑盒的操作步驟提取出的 DNA）1 μL，加入 ddH2O至 25 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃30 s，35個循環后，72℃延伸10 min。取10 μL擴增產物進行電泳，觀察結果。

1.2.3.3 血清型鑒定 參照1.2.3.2的方法，用APP1型的特異性引物P3，P4擴增，將擴增結果進行測序并用Blast比對。

1.2.4 毒力試驗 試驗動物為2月齡斷奶健康的保育豬8只。試驗動物分為2組：對照組4只，試驗組4只。將鑒定的1型APP接種TSB液體培養基，37℃搖床培養18 h后，連續10倍稀釋涂布TSA平板，活菌計數，計算原液菌體濃度，調整至108cfu/mL，試驗組動物通過滴鼻感染3 mL 1型APP，對照組動物通過滴鼻接種3 mL滅菌的TSB液體培養基。連續觀察14 d，并記錄其發病數和死亡數等情況。

1.2.5 免疫原性試驗 將分離的1型APP接種到TSB液體培養基，18 h后收取培養物，測定濃度，調整培養物中的菌數為2×109cfu/mL，每1 000 mL菌液加2 mL甲醛溶液，于37℃滅活12 h。滅活后的菌液按體積比1∶1加入氫氧化鋁佐劑，混合制得傳染性胸膜肺炎放線桿菌滅活疫苗。

選取2月齡健康仔豬10頭，分為2組，每組5頭。疫苗組注射本疫苗2 mL，對照組為未免疫組，注射2 mL滅菌生理鹽水。疫苗組和對照組21 d后二免注射同等劑量的疫苗或滅菌生理鹽水。二免后14 d各組用109cfu的APP菌液采取滴鼻攻毒，觀察仔豬的臨床表現，并每天測定體溫，共觀察14 d。對死亡豬肺臟等器官進行APP分離培養。

1.2.6 藥敏試驗 參考文獻[13-14]，采用K-B藥敏紙片法，將純化的菌落均勻涂布于TSA平板上，將藥敏紙片貼于培養基表面，37℃培養24 h，測定抑菌環的直徑，依據抑菌環直徑判斷標準來判定結果。

2 結果與分析

2.1 培養特性

37℃恒溫培養箱中培養24 h，長出一致的圓形凸起、半透明、光滑、濕潤的直徑大小為1.0～1.5 mm的菌落，45°折射光下觀察具有明顯的金紅帶藍色虹光（圖1）；在不含NAD的TSA培養基上不能生長。革蘭氏染色結果顯示，該菌為革蘭氏陰性菌，球桿菌、小桿菌、部分形成絲狀的菌體（圖2）。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 APP鑒定 對疑似APP的菌落進行APP的擴增，結果擴增出與預期大小一致的條帶（圖3），測序結果顯示，與傳染性胸膜肺炎放線桿菌8392株ApxIVA 基因（GenBank No.AF188867）達 99.5%同源。

2.2.2 血清型鑒定 用1型APP的特異性引物P3，P4擴增，結果擴增出959 bp大小片段（圖3），測序結果顯示，與1型傳染性胸膜肺炎放線桿菌4074株（GenBank No.AF518558）達 100%同源，證明分離菌株為1型APP。

2.3 毒力試驗

試驗組動物在接種分離的1型APP 12 h后表現出呼吸困難等癥狀，體溫升高，耳部、腹部及臀部發紺，最后臥地不起，肌肉抽搐，窒息死亡，死前口鼻流出帶泡沫的血液；第2天死亡1頭，2 d后死亡3頭；對照組動物在試驗期間正常。試驗結束后，剖殺試驗組動物和對照組動物，采集病料，進行APP分離。其中，試驗組剖檢肺紫紅色，切面多汁，血色液體流出，氣管、支氣管充滿泡沫狀、血性黏液；對照組剖檢均未發現病理變化，對照組的4份病料均未分離到APP，而試驗組的4份病料中均分離到APP，PCR鑒定結果與分離菌一致。

2.4 免疫原性試驗

結果顯示，疫苗組與未免疫組存在明顯的差異，攻毒后第2天，未免疫組的仔豬開始出現臨床癥狀，體溫升高，呼吸困難，開始出現死亡，死前口鼻流血，3 d內共死亡5頭；剖檢未免疫組死亡豬肺臟腫大出血，氣管充滿血性泡沫物。而疫苗組的5頭仔豬沒有發病，無臨床癥狀，剖檢無明顯病變。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，本次分離的1型APP敏感的藥物有：頭孢哌酮、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢唑林、頭孢他定、頭孢氨芐、利福平、萬古霉素。耐受的藥物有：多粘菌素、新霉素、復方新諾明、克林霉素、阿米卡星、環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、左氟沙星、阿奇霉素、四環素、壯觀霉素、紅霉素、卡那霉素、強力霉素、慶大霉素、羅紅霉素、林可霉素、痢特靈、桿菌肽、呋喃唑酮、氨曲南、苯唑西林、哌拉西林、青霉素、氯霉素。

3 討論

本試驗分離的菌株1型APP分離自發生典型呼吸困難急性死亡的育肥豬的心臟，在TSA固體培養基上分離時無其他細菌生長，只有傳染性胸膜肺炎放線桿菌生長，而且經鑒定為毒力最強的1型。動物回歸試驗顯示，本試驗分離的菌株1型APP對保育豬具有較強的致病力，引起保育豬發病死亡，而且具有良好的免疫原性，免疫后對強毒的攻擊具有完全的免疫保護。藥敏試驗結果顯示，本試驗分離的APP主要對頭孢類抗生素敏感，對其他藥物多耐藥，與已有研究報道結果相近[13-19]。根據以上試驗結果，對未發病豬接種1型APP疫苗，對發病豬敏感藥物治療，及時地控制了疫情，減少了損失。