草莓脫毒組培苗低成本快繁技術(shù)研究

張春芬，鄧 舒，聶園軍，趙海靜，肖 蓉，董艷輝，侯麗媛 ，孟玉平 ，曹秋芬

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

近年來(lái)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)由原來(lái)的實(shí)驗(yàn)室研究逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢詾榇笠?guī)模工廠(chǎng)化育苗服務(wù)的有效科技手段[1-3]，鑒于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的先進(jìn)性，將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐無(wú)疑可以帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益[4-5]。而在現(xiàn)代工廠(chǎng)化草莓種苗生產(chǎn)中，脫毒苗的組織培養(yǎng)是首要環(huán)節(jié)，也是重要的組成部分，在保證種苗生產(chǎn)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，提高繁殖系數(shù)、降低支出對(duì)于生產(chǎn)和節(jié)約能源都具有非常重要的意義[6]。

本試驗(yàn)立足于生產(chǎn)型企業(yè)對(duì)草莓組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用的成本控制，從碳源種類(lèi)及濃度、凝固劑種類(lèi)及濃度、培養(yǎng)容器等方面進(jìn)行研究，旨在找到可行的低成本繁育技術(shù)應(yīng)用于草莓脫毒種苗的大規(guī)模工廠(chǎng)化生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室草莓無(wú)病毒組培材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同碳源及濃度對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響分別采用蔗糖 30 g/L，白砂糖 30，25，20，15 g/L 處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復(fù)3次，繼代培養(yǎng)25 d后，調(diào)查統(tǒng)計(jì)不定芽增殖的變化情況。

增殖系數(shù)＝總增殖芽個(gè)數(shù)/總接種芽個(gè)數(shù)（1）

1.2.2 不同凝固劑及濃度對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響 分別采用5.0%，6.0%，6.5%瓊脂粉和5.0%，6.0%，6.5%卡拉膠處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復(fù)3次，繼代培養(yǎng)25 d后，調(diào)查統(tǒng)計(jì)不定芽增殖的變化情況。

1.2.3 不同培養(yǎng)容器對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響分別采用 150，300 mL 三角瓶和 180，240，350 mL玻璃瓶處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復(fù)3次，繼代培養(yǎng)25d后，調(diào)查統(tǒng)計(jì)不定芽增殖的變化情況。

1.2.4 不同糖濃度對(duì)草莓組培苗生根的影響 分別采用白砂糖 5，10，15，20，30 g/L處理。基本培養(yǎng)基為1/2 MS，添加0.3 mg/LIBA。每瓶接3株，每處理10瓶，重復(fù)3次，接種28 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以上培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基，均添加0.5mg/L6-BA，0.1mg/LIBA[7]，3%蔗糖和6.5 g/L瓊脂，pH值為5.8，培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，自然冷卻后備用。培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，14 h 光照，光照強(qiáng)度為 3 000 lx。

1.3 低成本生產(chǎn)效益核算

本試驗(yàn)中采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基配方中的各化學(xué)物質(zhì)成本進(jìn)行計(jì)算，價(jià)格為目前市場(chǎng)售價(jià)（2016年）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源及濃度對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響

從表1可以看出，在繼代培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖與白砂糖對(duì)4種草莓脫毒苗的增殖系數(shù)都無(wú)明顯影響，增殖系數(shù)分別為紅顏8.43/8.23，豐香 6.21/6.13，甜查理 7.99/7.95，章姬8.01/7.98；組培苗生長(zhǎng)表現(xiàn)正常，植株比較健壯，說(shuō)明無(wú)論蔗糖還是白砂糖都能給草莓脫毒苗提供足夠的碳源，滿(mǎn)足其正常生長(zhǎng)。然而，蔗糖的價(jià)格明顯高于白砂糖，一般是白砂糖的3～4倍，因此，考慮到生產(chǎn)成本，工廠(chǎng)化規(guī)模生產(chǎn)中完全可以用白砂糖代替蔗糖。比較20，25，30 g/L不同白砂糖質(zhì)量濃度可知，其沒(méi)有明顯差異，15 g/L小苗生長(zhǎng)瘦弱，且略顯發(fā)黃，由于碳源不足對(duì)組培苗的生長(zhǎng)有一定的影響。在草莓的組培苗生長(zhǎng)過(guò)程中，20，25，30 g/L白砂糖之間不存在顯著差別，考慮到成本，在工廠(chǎng)化生產(chǎn)中可以用20 g/L的白砂糖代替30 g/L的蔗糖。

表1 不同碳源及濃度對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響

2.2 不同凝固劑及濃度對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響

表2 不同凝固劑對(duì)草莓（紅顏）組培苗生長(zhǎng)的影響

由表2可知，不同凝固劑濃度對(duì)組培苗的增殖系數(shù)存在一定的影響。其中，5.0%瓊脂粉和5.0%卡拉膠為凝固劑時(shí)，培養(yǎng)基為半凝固狀態(tài)，組培苗增殖少，而且呈現(xiàn)玻璃化；凝固劑濃度較大時(shí)即7.0%瓊脂粉和7.5%卡拉膠為凝固劑時(shí)，培養(yǎng)基呈現(xiàn)不透明狀態(tài)，硬度變大，組培苗生長(zhǎng)健壯，但是增殖系數(shù)減少，分別只有4.56和4.54；6.0%瓊脂粉和6.5%卡拉膠為凝固劑時(shí)，培養(yǎng)基硬度適中，組培苗生長(zhǎng)健壯，且增殖系數(shù)較大。比較2種不同的凝固劑對(duì)草莓組培苗的增殖情況可知，二者之間差異不顯著，但是，與瓊脂粉相比，卡拉膠相對(duì)較便宜，從生產(chǎn)成本考慮，最適合的凝固劑用量為卡拉膠6.5 g/L。

2.3 不同培養(yǎng)容器對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響

從表3可以看出，組培瓶的大小對(duì)草莓組培苗的生長(zhǎng)影響不大，封口方式顯著影響了草莓組培苗的增殖。其中，紅顏在350 mL帶蓋的大瓶中增殖系數(shù)最大，為7.21；其次為250 mL三角瓶，增殖系數(shù)為6.60；180 mL帶蓋的培養(yǎng)瓶增殖系數(shù)為6.25，三者之間差異不顯著。豐香在350 mL帶蓋的組培瓶、250 mL三角瓶和180 mL帶蓋的培養(yǎng)瓶的增殖系數(shù)分別為3.95，4.00，3.90，三者之間差異不顯著。使用塑料膜封口的組培苗在繼代培養(yǎng)14 d后，培養(yǎng)基由透明轉(zhuǎn)為不透明，在植株基部出現(xiàn)裂縫，培養(yǎng)基開(kāi)始變硬，增殖系數(shù)相較于塑料蓋下顯著降低，紅顏草莓在180，350 mL塑料膜封口的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的增殖系數(shù)分別為3.31和3.75，豐香則僅為1.80和2.00。

表3 不同培養(yǎng)容器對(duì)草莓組培苗生長(zhǎng)的影響

2.4 不同白砂糖濃度對(duì)草莓組培苗生根的影響

草莓的組培苗極易生根，在不添加任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基中也能生根。從表4可以看出，在相同的激素水平下，不同白砂糖質(zhì)量濃度對(duì)生根有一定的影響，較低的白砂糖濃度時(shí)，生根量少且纖細(xì)，10，15 g/L之間生根量差異不顯著，但是根系生長(zhǎng)情況有所不同，相對(duì)于15 g/L處理，10 g/L白砂糖質(zhì)量濃度，根系纖細(xì)而且較短，不利于植株的移栽。15，20，30 g/L白砂糖之間生根條數(shù)差異不顯著，且根系都較粗，移栽成活率高。綜合生產(chǎn)成本考慮，生根用培養(yǎng)基白砂糖質(zhì)量濃度以15 g/L為宜。

表4 白砂糖不同質(zhì)量濃度對(duì)生根的影響

2.5 培養(yǎng)成本核算

從表5可以看出，不考蔗糖和瓊脂粉，配制1 L的MS培養(yǎng)基需要藥品總成本約為0.21元，添加蔗糖30 g、瓊脂粉6.0 g，則費(fèi)用增加為2.47元，其中，蔗糖1.296元，占到總成本的52.5%，瓊脂0.96元，占到總成本的38.9%。因此，降低培養(yǎng)基配制成本要重點(diǎn)放在蔗糖和瓊脂粉的成本方面。

由表6可知，用白砂糖替換蔗糖，成本可降低1.096元；卡拉膠替換瓊脂粉，成本可降低0.57元，總成本降為原來(lái)的32.5%（0.803/2.469），在大規(guī)模的工廠(chǎng)化生產(chǎn)中，培養(yǎng)基的需求量很大，這樣可大大節(jié)約總的生產(chǎn)成本。

表5 基本培養(yǎng)基（MS）成本

表6 降低成本前后培養(yǎng)基比較（1 L）

2.6 培養(yǎng)容器成本核算

從表7可以看出，以接種1 000瓶脫毒苗為例，使用250 mL三角瓶，1 000個(gè)三角瓶的容器成本為5 000元，培養(yǎng)基要配置40 L才能滿(mǎn)足分裝，總成本為5 032.1元；相同條件下，用350 mL培養(yǎng)瓶需要40 L培養(yǎng)基和3 000元容器成本，如果換成180 mL培養(yǎng)瓶則只需要25 L培養(yǎng)基和2 500元容器成本；同時(shí)，三角瓶封口一般以塑料膜封口，需用棉線(xiàn)捆綁，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而培養(yǎng)瓶采用塑料蓋封口時(shí)快速省時(shí)，節(jié)約了勞動(dòng)力，從而節(jié)省了培養(yǎng)成本，為草莓脫毒苗的規(guī)模化工廠(chǎng)化生產(chǎn)提供了節(jié)約時(shí)間、降低成 本的途徑。

表7 培養(yǎng)容器的培養(yǎng)成本

3 結(jié)論與討論

草莓脫毒苗的工廠(chǎng)化生產(chǎn)過(guò)程分為3步，首先是原原種苗，即脫毒種苗的繁育；其次是原種苗，即由原原種苗匍匐莖出芽獲得的二級(jí)子苗；第3步為生產(chǎn)苗的繁育，是通過(guò)原種苗的匍匐莖出芽獲得的三級(jí)子苗[8]。原原種苗的生產(chǎn)主要采用組織培養(yǎng)技術(shù)，因此，生產(chǎn)企業(yè)要想在大規(guī)模中取得更大的生產(chǎn)效益，必須考慮降低組培苗的生產(chǎn)成本，而培養(yǎng)基是組培苗成本的重要組成部分[9]，通過(guò)降低培養(yǎng)基成本是控制成本的重要方法之一。

本研究表明，蔗糖在培養(yǎng)基配制中用量大，成本也高，占到培養(yǎng)基成本的52.5%。其主要作用是為植物提供碳源和維持培養(yǎng)基中滲透壓，因此，糖濃度的變化可以調(diào)節(jié)滲透壓，并因此影響到植物的生長(zhǎng)發(fā)育。大多數(shù)試驗(yàn)多以蔗糖為碳源[10-12]，本研究發(fā)現(xiàn)，用白砂糖代替蔗糖同樣可滿(mǎn)足草莓生長(zhǎng)發(fā)育的需求，而且將白砂糖質(zhì)量濃度降到20 g/L時(shí)，草莓苗仍可健壯生長(zhǎng)，很大程度上降低了生產(chǎn)成本。

同碳源相似，凝固劑在培養(yǎng)基總成本中也占有較大的比例，是工廠(chǎng)化育苗成本過(guò)高的原因之一[13-14]。大多數(shù)研究中，選用瓊脂粉作為凝固劑，而瓊脂粉在培養(yǎng)基中只起到凝固培養(yǎng)基的作用，它并不是植物生長(zhǎng)中必不可少的，本研究中，采用較便宜的卡拉膠來(lái)代替瓊脂，草莓植株的生長(zhǎng)沒(méi)有受到明顯的影響。本研究表明，隨著瓊脂粉濃度的降低，培養(yǎng)基硬度變小，甚至不能完全凝固，從而導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)相對(duì)濕度較大，接種時(shí)很難固定在培養(yǎng)基中，接種后草莓苗易玻璃化。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，也不能一味地降低成本，要同時(shí)兼顧苗木質(zhì)量，在組培繼代中，隨時(shí)觀(guān)察繼代不同代數(shù)后苗木的質(zhì)量，從而對(duì)培養(yǎng)基中的瓊脂粉予以調(diào)整。

在植物組培苗的工廠(chǎng)化生產(chǎn)中，由于培養(yǎng)容器的需求量較大，因此，價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便的容器可大幅度降低生產(chǎn)成本[15]。一般實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行組織培養(yǎng)所用容器都用玻璃三角瓶，由于其透光性好，特別適于科學(xué)研究，但其價(jià)格昂貴且易碎，不利于工廠(chǎng)化生產(chǎn)操作，在工廠(chǎng)化大規(guī)模的生產(chǎn)中會(huì)相應(yīng)地增加生產(chǎn)成本[16]。現(xiàn)在生產(chǎn)中，多用塑料瓶或玻璃瓶代替三角瓶進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[17-18]，不僅價(jià)格便宜，而且便于洗滌和接種工人大批量操作，可節(jié)省勞動(dòng)力，有效地降低生產(chǎn)成本，極大地提高生產(chǎn)效率。