我院干細胞實驗室的標準化設計和建設

劉廣全，梁偉，袁明泉，任少達

1. 聊城市人民醫院 a. 醫療設備處；b. 干細胞臨床研究實驗室，山東 聊城 252000；2. 聊城市水利勘測設計院，山東 聊城 252061

引言

干細胞是一類具有自我更新、多向分化潛能、高度增殖的細胞群體，可以分化成各種組織器官的祖細胞，是再生醫學中重要的種子細胞[1-4]。干細胞可以治療多種疾病，包括對阿爾茲海默病、帕金森病、肝硬化、CO中毒遲發性腦病、多系統萎縮、運動神經元病、多發性硬化、腦血管病和腦外傷后遺癥、腦癱、慢性肝病及醫學美容中的抗衰老、治療脫發等均有顯著療效[5-10]。目前，在美國國立衛生研究院注冊網址已有6000多項干細胞相關的臨床研究。2015年8月，原國家衛生和計劃生育委員會聯合國家食品藥品監督管理局共同頒布了《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》和《干細胞制劑質量控制及臨床研究指導原則（試行）》，用于規范我國干細胞的臨床研究，保障干細胞的臨床使用安全。

2015年之前，我院與國家工程研究中心合作，開展了對阿爾茲海默病、帕金森、肝硬化、CO中毒遲發型腦病、多系統萎縮、腦血管病、慢性肝病等百余例患者的干細胞臨床研究，總有效率75%，無過敏及其他不良反應發生。為了進一步發展我院的干細胞臨床研究，2015年5月我院在原有實驗室的基礎上進行了標準化的設計和建設。新建GMP實驗室建筑面積1000 m2，包括生產制備區、質量檢測區、細胞儲存區等。主要從事干細胞臨床前基礎研究、臨床轉化研究等，包括臍血、臍帶、脂肪、骨髓來源干細胞的分離、純化、擴增等。

1 干細胞實驗室的設計內容

1.1 干細胞實驗室的建設總體原則

干細胞實驗室的選址、設計及布局應遵循《藥品生產質量管理規范》《實驗室生物安全通用要求》（GB19489）、《醫院潔凈手術部建筑技術規范的規定》（GB50333），質量檢測區應符合GB/T 27025檢測和校準實驗室能力的通用要求。最終達到布局合理、獨立使用、人物分流的要求，應具備細胞分離、培養擴增、凍存復蘇、質量檢測控制、制劑運輸、設備及環境遠程控制、信息管理系統等功能[11-12]。潔凈區房間的房門應具有自動關閉功能，通道門還應具有聯動互鎖功能。潔凈區建筑材料應隔熱、防震、防蟲、防火，不產塵、不吸塵、不積塵等。儀器設備應具有標準數據通信接口等輸出有關數據，支持中央數據處理系統進行控制和綜合分析處理等。

1.2 干細胞實驗室的功能設計

干細胞的工作流程，如圖1所示，主要分為干細胞的制備、質檢及存儲。其中干細胞的質檢管理又包括無菌檢測、致病因子檢測、培養基殘余量檢查等。

圖1 干細胞制備流程圖

根據干細胞實驗室的建設原則和工作流程，我院干細胞實驗室的設計主要包括更衣區、樣本接收區、細胞制備區、細胞培養區、質量檢測區（PCR檢測區、微生物檢測區、功能檢測區）、細胞庫、檔案室、信息中心等區域。區域設計的平面圖，見圖2。

圖2 干細胞實驗室設計平面圖

根據SZDB/Z 188-2016細胞制備中心建設與管理規范，更衣區分為一更和二更。更衣區的面積不低于30 m2，該區域應配備自動洗手設備、潔凈風烘干設備、感應式消毒液給液設備。

樣本接收區面積應不低于20 m2，應具有4℃醫用冰箱、電子天平、恒溫培養箱等。

細胞制備區用于干細胞的分離，面積應不低于200 m2，包括試劑儲備間、細胞分離室等房間。細胞制備區應具備生物安全柜、CO2培養箱、冷凍離心機、倒置顯微鏡、細胞計數儀、4℃醫用冰箱等。

細胞培養區用于干細胞的培養和擴增，面積應不低于100 m2，我院共有4個培養區。每個培養區均配置生物安全柜、倒置顯微鏡、CO2培養箱、4℃醫用冰箱等。其中樣本接收區、細胞制備區和細胞培養區均配備萬級層流凈化環境。

質量檢測區主要用于干細胞確認檢驗及放行檢驗，面積應不低于300 m2，我院質量檢測區分為PCR室、微生物室及功能檢測室三部分。PCR室分為試劑制備區、標本制備區、樣本擴增分析區三個部分。PCR三個區域的空調系統完全獨立，其中試劑制備區和標本制備區為相對正壓狀態，樣本擴增分析區為相對負壓狀態，每個區域和緩沖區之間均保持10 Pa的壓差。標本制備區配備有B2型生物安全柜，需要考慮到安全柜運行時，要補充相應數量的新風。另外產物分析區配有排風櫥，也需要補充一定數量的新風。PCR室應配備4℃醫用冰箱、生物安全柜、離心機、熒光定量PCR儀等儀器。微生物室為檢測干細胞的病原微生物，主要配備生物安全柜、全自動微生物培養檢測儀等儀器。功能檢測室需要配備流式細胞儀、酶標儀、細胞計數儀、醫用冰箱、純水儀、凝膠成像系統、電泳儀、離心機等。

細胞庫面積應不低于60 m2，主要為干細胞的儲存場所。具有液氮罐、程序降溫儀、超低溫冰箱、液氮塔等，配備實時環境、安全監控，如氧濃度檢測系統、溫濕度檢測系統等。

2 干細胞信息系統的建設

干細胞臨床研究實驗室應設有信息化管理系統，制定嚴格的操作規定、安全保密規則，確保信息系統安全運行[13-16]。同時應建有信息備用系統，一旦電子數據庫出現故障后，備用系統可以工作使實驗室順利運轉。我院的信息系統包括干細胞制劑生產管理系統、干細胞制劑質量控制管理系統、干細胞臨床研究備案項目管理系統。干細胞臨床研究機構主任作為信息系統的最高管理者，日常具體運行由質量受權人負責。生產管理系統可以管理樣本收集、處理、擴增、凍存、運輸等，可以接收臨床項目負責人從項目管理系統提交的細胞申請，向質量管理系統提交干細胞的確認檢驗及放行檢驗，接收質量授權人的放行命令，向臨床項目負責人發送接收細胞邀約；質量管理系統可以管理包括細胞鑒別、存活率、純度、無菌、支原體檢測、內毒素檢測、免疫學檢測、培養基及其他添加成分殘余量等，可以接收生產管理系統發出的檢測申請，同時向質量受權人發生檢測結果；備案項目管理系統包括項目申請、學術委員會評審、倫理委員會評審、受試者信息管理、電子病歷管理、隨訪管理、不良反應事件管理等。三個信息關系子系統相互獨立，又能實現數據間的相互交流。

3 成果

經過標準化的設計和施工，干細胞實驗室建設順利完工，圖3為細胞制備室的現場圖。干細胞實驗室的標準化設計與建設，為我院的干細胞臨床研究的發展奠定了良好的基礎。2016年4月我院成為國家首批干細胞臨床研究機構，2017年神經內科、骨科和消化內科申報三項國家干細胞臨床研究備案項目。其中消化內科的一次性獲得國家批準備案，現已完成一例病人入組；神經內科、骨科項目已按照修改意見完成備案標書的修改工作，有望下一次獲得國家批準。2018年，原國家衛計委領導及全國干細胞專家到現場審核并順利通過。

圖3 細胞制備室現場圖

4 展望

我院爭取將消化內科的項目《脂肪間充質干細胞治療中重度潰瘍性結腸炎有效性及安全性的I/Ⅱ期隨機對照臨床研究》高水平高質量完成。在此之基礎上，制定間充質干細胞治療結腸炎的國家乃至國際標準，爭取申報并獲得國家干細胞重大專項的資助。我們同時積極拓展干細胞在其他病種的臨床試驗，爭取為更多患者解除痛苦，使我院干細胞臨床研究水平達到國家一流水平。