正交試驗法優(yōu)選偏散湯顆粒的提取工藝

256500博興縣中醫(yī)醫(yī)院，山東省 博興

散偏湯出自《辨證錄·頭痛門》，為清代醫(yī)家陳士鐸所創(chuàng)，原文描述其癥狀為：“人有患半邊頭風者，或痛在右，或痛在左，大約痛于左者為多，……其病有時重有時輕，大約遇順境則痛輕，遇逆境則痛重，遇怫抑之事而更加之風寒之天，則大痛而不能出戶。”陳士鐸總結(jié)其病機為肝膽郁氣不宣，又加風邪侵襲少陽經(jīng)，治宜急解少陽郁氣，以川芎行氣活血止痛，合白芍平肝氣、生肝血；郁李仁、白芷助川芎以散頭風；柴胡、香附開肝膽郁氣；白芥子消痰；甘草調(diào)和滯氣[1，2]。組方為白芍5錢，川芎1兩，郁李仁1錢，柴胡1錢，白芥子3錢，香附2錢，甘草1錢，白芷5分，水煎服。清代的衡制1兩約37.3 g，1錢約3.7 g[3]，折合現(xiàn)代劑量，每張?zhí)幏絼┝考s87 g。因處方劑量較大，為便于患者服用，故制成顆粒劑。

資料與方法

儀器：AE240S型電子分析天平(METTLER TOLEDO)，高效液相色譜儀(日本島津)，LC-15C泵，SPD-15C檢測器，色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

對照品：芍藥苷(中國食品藥品檢定研究院，20 mg/支，110736-201713，經(jīng)面積歸一化法測定，含量95.1%)。

試劑：乙腈、磷酸為色譜純，水為重蒸去離子水，其余試劑均為分析純。

藥材：均來自本院中藥房。

結(jié) 果

水提正交試驗設(shè)計：分別稱取白芍92.5 g，川芎185 g，郁李仁18.5 g，柴胡18.5 g，白芥子55.5 g，香附37 g，甘草18.5 g和白芷9.25 g，每份計434.75 g，共9份，參考相關(guān)文獻，選取加水量、提取次數(shù)和時間3個因素，藥材浸泡0.5 h后按L9(34)進行正交優(yōu)選試驗，以提取液中芍藥苷含量和出干膏得率為綜合評價指標進行評價，所選因素水平見表1。

表1 因素水平

芍藥苷含量測定[4]：①色譜條件：填充劑選十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相是乙腈0.1%磷酸溶液(15：85)；檢測波長230 nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于2 000。②對照品溶液制備：精密稱取對照品芍藥苷適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。③供試品溶液制備：分別精密移取各提取液10mL，水浴蒸至2 mL并轉(zhuǎn)移到25 mL量瓶中，加甲醇15 mL稀釋，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。④陰性樣品溶液制備：按散偏湯顆粒提取方法制備提取液，精密移取10 mL，處理方法同“③”，得到陰性樣品溶液。⑤線性與范圍：精密稱取芍藥苷對照品(10.16 mg)，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，分別精密移取上述對照品貯備液1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL和9.0 mL置于10 mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作對照品溶液，分別吸取上述溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定。以芍藥苷濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程A=20745c-23701，r=0.999 2。結(jié)果表明，在20.32～182.88 μg/mL濃度范圍內(nèi)，芍藥苷峰面積值與濃度具有良好線性關(guān)系。⑥精密度試驗：取芍藥苷對照品溶液(60.96 μg/mL)20 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，計算峰面積積分值的RSD，結(jié)果峰面積RSD=0.51%，儀器精密度良好。⑦重復性試驗：取同一樣品6份，處理方法同“③供試品溶液制備”，分別吸取上述溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，每個樣品分別平行測定2次，計算芍藥苷含量RSD，結(jié)果含量RSD1.31%，該方法重復性良好。⑧穩(wěn)定性試驗：取同一樣品溶液分別于0、2、4、6、8和12 h進樣，計算峰面積積分值的RSD，結(jié)果RSD0.93%，供試品溶液在12 h范圍內(nèi)穩(wěn)定。

出膏率：精密移取各提取液60 mL，分別置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至近干，105℃干燥3 h，精密稱定，計算。

最佳工藝確定：正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3～4。①正交試驗及結(jié)果，見表2。②方差分析，見表3、表4。③結(jié)果：以散偏湯顆粒提取液中芍藥苷含量和出干膏率為綜合評價指標，均為因素B＞A＞C，直觀提取工藝為藥材加10倍量水提取2次，1.5 h/次。最佳工藝為藥材加8倍量水提取2次，1.5 h/次。

工藝驗證：稱取散偏湯顆粒處方中各藥材6份，分直觀提取工藝組和最佳工藝組，每份藥材總量計434.75 g，分別按直觀最佳工藝A3B2C2和優(yōu)選工藝A2B2C2提取，以上述方法測定，見表5。

結(jié)果表明，直觀工藝與優(yōu)選工藝無明顯差異，最終確定藥材加8倍量水提取2次，1.5 h/次，該提取工藝驗證3次，芍藥苷含量和出膏率穩(wěn)定。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 芍藥苷含量方差分析

表4 出膏率方差分析

表5 提取工藝驗證試驗結(jié)果

討 論

為保持傳統(tǒng)方劑的特點，結(jié)合古代經(jīng)典名方的制備工藝，以水提取，并對白芍中的有效成分芍藥苷做了含量測定，結(jié)合出膏率，以兩者為綜合評價指標，進行正交試驗提取，結(jié)合經(jīng)濟因素等綜合考慮，優(yōu)選出散偏湯顆粒用8倍量水提取2次、1.5 h/次的提取工藝。

因確定的提取工藝未在正交試驗中，為驗證優(yōu)選工藝與直觀工藝中芍藥苷含量和出膏率的差異，分別對直觀工藝與優(yōu)選工藝進行了3批驗證。結(jié)果表明，優(yōu)選的最佳工藝與直觀最佳工藝無明顯區(qū)別，優(yōu)選工藝中的芍藥苷含量和出膏率穩(wěn)定。