替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用

何小蘇，鄒紅群，李啟艷,3，高 源，張枝雪，趙海榮，張成桂，肖 懷

(1. 大理大學云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南 大理 671000；2. 大理白族自治州人民醫院體檢中心，云南 大理 671000；3. 云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院，云南 昆明 650032)

腦缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病和多發病。腦缺血損傷與細胞凋亡的關系非常密切，在腦缺血后的幾小時內，缺血半暗帶或梗死區周圍的神經元死亡主要以凋亡性死亡為主。其中，海馬CA1 區的錐體神經元對全腦缺血引起的損傷尤為敏感，再灌注2～4 d后，該部位出現錐體神經元遲發性死亡[1-2]。基于神經細胞凋亡與腦缺血損傷關系的深入研究，神經保護源的研究成為抗腦缺血研究的主要焦點。缺血性腦血管病目前常規的治療，采用抗凝、抗血小板聚集、溶栓、針對卒中單元的改善等。替格瑞洛(ticagrelor)是一種新型抗血小板藥物，口服后無代謝激活，可與血小板表面的P2Y12受體蛋白可逆結合，拮抗血小板聚集[3]，P2Y12 受體蛋白屬于G蛋白偶聯受體家族，是抗血小板聚集藥物研發的常用靶點。臨床上用于預防急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者的血栓栓塞。相關報道還顯示，替格瑞洛除具有抗血小板作用，還具有神經保護作用[4]。因此，本實驗以四血管阻塞法(four-vessel occlusion，4-VO)，即雙側椎動脈、雙側頸總動脈阻塞15 min制備大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型，探討替格瑞洛對大鼠海馬組織CA1區神經元數目的影響，以研究其對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的神經保護作用，為后續研究替格瑞洛神經保護機制及臨床開發藥物新用途提供一定的實驗依據。

1 材料

1.1實驗動物SPF級健康♂Wistar大鼠，體質量(250～300) g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。實驗動物在大理大學實驗動物中心實驗室適應性飼養1～2周后，用于正式實驗。飼養條件：清潔級，室溫(16～22) ℃，相對濕度70%，12 h明暗交替照明，自由進食、飲水。動物處置方法均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則要求。

1.2藥物與試劑替格瑞洛(批號：0868314002)，購自Astra Zeneca AB；多聚甲醛(批號：20151115)，購自天津市光復精細化工研究所；水合氯醛(批號：20170712)，購自國藥集團化學試劑有限公司；注射用青霉素鈉(批號：F7032114)，購自華北制藥股份有限公司；薇婷脫毛膏(批號：J20170017)，購自利潔時家化(中國)有限公司。

1.3儀器AggRAM血小板聚集儀(Helena Laboratories公司)；TCL16M型臺式高速冷凍離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)；Elektrisk kniv型電凝器(精益醫療器械有限公司)；MOTIC倒置顯微鏡(日本SPEED FAIR公司)。

2 方法

2.1模型的制備所有大鼠于實驗前1 d，用脫毛膏將枕骨部位毛發脫干凈，以便進行手術及防止手術后傷口感染。參考Pulsinelli等[5]和李兵等[6]的4-VO 15 min法復制模型，主要分3個步驟：(1)大鼠以10%水合氯醛300 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于直流加熱墊上(溫度控制在37 ℃)，酒精消毒后備皮，在頸部正中切口約1.5 cm，暴露雙側頸總動脈，并在兩側頸總動脈穿線套扣，再縫合頸部傷口。(2)俯臥位固定，在枕骨后切開皮膚，暴露第1頸椎兩側的翼小孔，用尖端直徑為0.5 mm的電凝器，插入翼孔，燒灼雙側的椎動脈，造成永久性閉塞，再縫合頸部傷口，注射青霉素。(3)待動物適應24 h后，用異氟烷吸入式麻醉大鼠后，剪開在頸部正中的切口，用鑷子輕輕拉出套扣，暴露兩側頸總動脈，再夾閉兩側頸總動脈，夾閉時間為15 min，此為全腦缺血期。15 min后松開動脈夾，并除去套扣，可恢復血流，進行再灌注實驗，此為缺血后再灌注期。缺血達到以下標準，即夾閉雙側頸總動脈10 s內，大鼠出現意識喪失、角膜反射和翻正反射消失，可見大鼠四肢上舉，雙側瞳孔散大，眼球呈灰白色，身體可呈角弓反張，并在15 min缺血期內，意識和上述反射均未恢復者，視為手術成功，方可實施再灌流及治療給藥。在缺血期死亡或僅出現昏睡，以及在整個實驗過程中出現抽搐的大鼠均被剔除。假手術組不進行雙側椎動脈電凝，也不夾閉雙側頸總動脈，其余操作相同。

2.2動物分組及給藥將造模成功大鼠分為模型組、替格瑞洛低、中、高劑量組(37.5、75、150 mg·kg-1)，每組10只。分別于造模后2、24、48 h給藥，替格瑞洛按照相應劑量灌胃0.08 mL·kg-1，假手術組和模型組等體積灌胃生理鹽水，連續治療給藥3 d，每天1次。

2.3指標檢測

2.3.1大鼠卒中指數和神經病學評分 大鼠再灌注2、24、48 h后，分別進行卒中指數(apoplexy index)和神經病學癥狀(neurology symptom)評分。卒中指數評分標準[7]：毛發臟亂顫抖，1分；運動減少或遲鈍，1分；耳觸覺遲鈍，3分；頭翹起，3分；后肢外展呈“八”字，3分；上瞼下垂，1分；轉圈，3分；驚厥或爆發運動，3分；極度虛弱，6分。總分25分，0～3分為癥狀組，3～9分為中間組，可能有損傷，>10分明顯有損傷。神經病學癥狀評分標準[8]：有自發探究，0分；刺激時能走動，1分；正常步態，0分；共濟失調，1分；爬行，2分；無步態，3分；能進食，0分；不能進食，1分；能飲水，0分；不能飲水，1分；疼痛刺激可移動，0分；僅頭或軀干運動，1分；肢體回縮或無反應，2分。總分10分，0分正常，1～3分輕度損傷，4～6分中度損傷，7～10分嚴重損傷。

2.3.2凝血功能檢測 末次給藥2 h后，各組大鼠以10%水合氯醛300 mg·kg-1腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，采用3.8%枸櫞酸鈉溶液抗凝(枸櫞酸鈉與血液容積之比為1 ∶9)，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，用全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(activated partial thrombophastin time，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、凝血酶時間(thrombin time，TT)和纖維蛋白原(fibrinogen，FIB)。

2.3.3血小板聚集率的測定 參考實驗方法[9]，大鼠以10%水合氯醛300 mg·kg-1腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，采用3.8%枸櫞酸鈉溶液抗凝(枸櫞酸鈉與血液容積之比為1 ∶9)，充分混勻后，25 ℃、1 022 r·min-1離心10 min，取上層血漿即得富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)。將剩余的血漿，25 ℃、4 571 r·min-1離心15 min后，取上層血漿即得貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)。參考文獻方法[10]，按比濁法測定3 min血小板最大聚集率。

2.3.4HE染色觀察組織病理學形態 所有大鼠腹主動脈取血后，用預冷的生理鹽水進行心臟灌流，直至右心耳流出的液體無色清亮時停止，再用4%多聚甲醛灌注固定。固定后立即取腦，去除嗅球及小腦，置10%中性福爾馬林液中24 h，于視交叉(左右兩條視神經在下視丘下面的會合)處切開取材，常規脫水，石蠟包埋，連續冠狀切片(厚度4～5 μm)，置37 ℃溫箱內烘烤1～2 h后，二甲苯脫蠟，進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察腦組織病變。

2.3.5Nissl染色檢測腦組織海馬CA1區神經元數目 前期處理同HE染色，切片、烘片、脫蠟后進行Nissl染色，在光鏡下觀察海馬CA1區的病理學變化，以及在400倍鏡下計數1 mm長度細胞條帶內細胞膜和核膜完整的神經元數目，取兩側海馬區神經元數目之和的平均數為CA1區正常神經元數，神經元密度(neuronal density，ND)[11]計算公式如下：

2.4統計學分析數據均用SPSS 21.0統計軟件處理，結果以表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行組間均數的顯著性檢驗，并以LSD-t檢驗進行多重比較。數據不符合正態性或方差不齊的采用非參數檢驗中的Mann-Whitney檢驗分析比較。

3 結果

3.1替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷卒中指數評分的影響Tab 1結果顯示，與假手術組比較，模型組、替格瑞洛各組卒中指數在再灌注2、24、48 h均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，替格瑞洛(37.5、75、150 mg·kg-1)組卒中指數在再灌注24 h(P<0.05)和48 h(P<0.01)時均降低。

Tab 1 Effects of ticagrelor on stroke index in rats with global cerebral ischemia/reperfusion injury n=9)

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle

3.2替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷神經病學評分的影響Tab 2結果顯示，與假手術組比較，模型組、替格瑞洛各組神經病學評分在再灌注2、24、48 h均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，替格瑞洛(37.5、75、150 mg·kg-1)組神經病學評分在再灌注48 h明顯降低(P<0.01)，2 h和24 h均有降低的趨勢。

Tab 2 Effects of ticagrelor on neurological functional scores in rats with global cerebral ischemia/reperfusion injury n=8)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsvehicle

3.3替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷血漿凝血四項的影響Tab 3結果顯示，與假手術組比較，替格瑞洛(37.5、75、150 mg·kg-1)組PT和TT未見明顯變化；APTT有延長的趨勢；FIB含量呈升高的趨勢，差異均無統計學意義(P>0.05)。

3.4替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷血小板聚集率的影響Tab 4結果顯示，與假手術組比較，模型組血小板聚集率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，替格瑞洛(37.5、75、150 mg·kg-1)組血小板聚集率均明顯降低(P<0.01)。

3.5替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注腦組織病理損傷的影響再灌注48 h，大鼠石蠟腦切片HE染色結果顯示(Fig 1)，假手術組海馬CA1區錐體神經元排列整齊緊密，有3～4層神經元，細胞紫藍色較深，細胞形態完整，邊界清晰；模型組海馬CA1區神經元體積縮小，有2～3層神經元，細胞紫藍色較淺，細胞膜皺縮內陷，形成泡狀小體即凋亡小體；替格瑞洛各劑量組海馬CA1區錐體神經元排列疏松，有2～3層神經元，細胞紫藍色較淺，細胞形態完整，邊界清晰，無小膠質細胞浸潤。

Fig 1 Hippocampal CA1 region of brain tissues (HE×400)

Tab 3 Effects of ticagrelor on coagulation in rats with global cerebral ischemia/reperfusion injury

Tab 4 Effects of ticagrelor on platelet aggregation rate induced by ADP in rats with global cerebral ischemia/reperfusion injury n=7)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsvehicle

3.6替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷海馬CA1區神經元數目的影響再灌注48 h，大鼠石蠟腦切片尼氏染色結果顯示(Fig 2)，假手術組大鼠海馬CA1區錐體細胞形態結構完整，排列整齊緊密，核膜核仁清晰，胞核飽滿，大量神經元存在；模型組大鼠海馬CA1區神經元細胞大量丟失，殘存的神經元體積縮小呈現固縮破裂，疏松變形，排列紊亂，胞體形狀不規則，核仁消失，出現大量空泡樣結構；細胞膜皺縮內陷，形成泡狀小體即凋亡小體；替格瑞洛各劑量組海馬CA1區錐體神經元排列較為緊密，細胞形態完整，邊界清晰。替格瑞洛治療能保持神經元細胞的結構完整性，并具有一定劑量依賴性，其中替格瑞洛150 mg·kg-1組細胞結構和形態已基本和假手術組一致。

Fig 2 Hippocampal CA1 region of brain tissues (Nissl, ×400)

Tab 5結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠海馬神經元數目明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，替格瑞洛(37.5、75、150 mg·kg-1)組大鼠海馬神經元數目明顯增加(P<0.01)，且與假手術組已基本無差異(P>0.05)。

Tab 5 Effects of ticagrelor on number of neurons of hippocampus in rats with global cerebral ischemia/reperfusion injury

**P<0.01vssham;##P<0.01vsvehicle

4 討論

本實驗采用的4-VO法是目前國際公認的全腦缺血動物模型制備方法之一，電凝雙側椎動脈加結扎雙側頸總動脈，達到全腦缺血目的，該方法制備的動物模型病理與人腦急性缺血性病變接近，且重復性強、成功率高。替格瑞洛是一種被批準用于治療急性冠脈綜合征的抗血小板藥物，其作為抗血小板聚集藥物，可拮抗P2Y12受體，抑制血小板活化和聚集，用于治療腦梗死和心肌梗死[3]。有證據表明，替格瑞洛在動物急性卒中模型中具有神經保護作用，本實驗旨在探討替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的腦組織海馬神經元的神經保護作用。缺血性腦卒中是全球最常見的死亡率和致殘率均較高的腦血管疾病之一。腦組織在缺血/缺氧損傷作用下，缺血半暗帶神經元發生一系列神經功能缺損形態學變化[12]。除引起神經功能障礙外，全腦缺血/再灌注損傷還有較強的區域敏感性，還可選擇性導致大鼠海馬及皮層損傷，其中海馬CA1 區錐體神經元最為敏感，缺血時極易受損。因此，以海馬 CAl 區作為觀察區域。缺血/再灌注3 d后，明顯看到大量 CA1區錐體細胞破壞，主要病變表現為神經細胞腫脹、核質空泡形成、核染色深，甚至神經細胞結構消失。本實驗結果表明，替格瑞洛對大鼠全腦缺血/再灌注引起的海馬神經元損傷有一定保護作用，具體表現為抑制CA1區神經元細胞固縮、濃染，減少神經元丟失，改善神經元形態的病變。缺血/再灌注損傷引起的神經細胞死亡主要有壞死和凋亡2種方式。細胞凋亡是重要的神經細胞死亡方式。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，可通過抑制caspase-3的生成和活化，發揮抑制凋亡的作用。本實驗還存在不足之處，未對神經細胞凋亡相關蛋白進行檢測，今后將對神經凋亡相關基因、蛋白進行檢測，以明確其神經保護作用機制。

抗血小板藥物能夠有效預防缺血性腦卒中的發病及復發，綜合國內外相關研究顯示，替格瑞洛是一個很有潛力的新型口服抗血小板聚集藥物。出血是所有抗血小板藥物首要的安全問題，不僅導致并發癥、死亡和醫療費用增加，而且由于抑制了血小板的活性，在受傷或手術等事件中給止血帶來困難[13]。替格瑞洛也不例外，但替格瑞洛與P2Y12受體的結合為可逆性結合，當替格瑞洛在體內代謝消除之后，ADP可與血小板的受體結合，使血小板重新恢復活性，循環中的血小板功能均能夠恢復，長期使用不會導致血小板水平呈破壞性下降。替格瑞洛還具有撤藥后藥效消失較快的特點，因此有益于降低出血可能性。林開敏等[14]研究結果顯示，替格瑞洛對臨床患者治療1個月后，替格瑞洛組出血事件的發生率為4.16%。替格瑞洛對全腦缺血/再灌注損傷大鼠血小板聚集率影響實驗結果顯示，替格瑞洛治療組血小板聚集率比Sham組低。因此，在臨床應用中應對其出血風險加強監控，以及使用可能增加出血風險藥物的患者慎用替格瑞洛，則可能降低替格瑞洛的使用風險，使其用藥安全、有效。

抗血栓形成的重要機制之一是抑制凝血系統的活化。凝血過程由于啟動環節不同，分為內源性與外源性凝血兩條途徑，其中反映內源性凝血途徑活性的是 APTT，反映外源性凝血途徑活性的是PT，而TT則反映了兩種途徑的共同影響因子凝血酶的活性。無論內源性，還是外源性凝血途徑，最終都通過激活凝血因子Ⅱ(凝血酶)使纖維蛋白原變為纖維蛋白，從而發生凝血[15]。本研究結果提示，替格瑞洛各劑量均可延長APTT、PT時間，表明替格瑞洛對凝血酶-纖維蛋白原反應有直接抑制作用，即替格瑞洛有凝血活性。

綜上所述，本實驗結果顯示替格瑞洛能降低大鼠卒中指數和神經病學評分，抑制大鼠血小板聚集，保護神經元結構的完整性，減少再灌注損傷海馬神經元丟失，對全腦缺血4-VO大鼠模型具有一定神經保護作用，其神經保護機制還需進行進一步相關實驗研究，以期闡明其神經保護機制，為替格瑞洛抗凋亡治療腦血管疾病提供實驗依據。