MAPK/ERK信號通路參與褪黑素對阿爾茨海默病大鼠小腦的神經(jīng)保護(hù)作用

劉 亭，畢 竟，王 盼，任麗莉，張露允，隋汝波

(錦州醫(yī)科大學(xué)1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科三病區(qū)、2. 遼寧省神經(jīng)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的，以記憶力進(jìn)行性減退、認(rèn)知功能障礙、精神及行為活動異常為主要特征的慢性神經(jīng)退行性疾病。在AD的早期研究中，很少有人會全面關(guān)注小腦的變化，可能是由于小腦長期以來被認(rèn)為僅在協(xié)調(diào)自主運(yùn)動和學(xué)習(xí)方面發(fā)揮主要的作用，再加上最初的小腦在細(xì)胞和分子水平不受累假說[1]。然而，越來越多的證據(jù)表明，在AD患者和AD動物模型中，小腦中也會出現(xiàn)Aβ淀粉樣蛋白的沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[2]，但有關(guān)神經(jīng)元丟失和其他結(jié)構(gòu)性變化報道較少[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要由細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)、氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)和p38-MAPK三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組成。腦內(nèi)MAPK/ERK通路可傳導(dǎo)細(xì)胞膜上的受體信號到細(xì)胞核內(nèi)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增殖、凋亡等，與學(xué)習(xí)記憶能力聯(lián)系緊密，且與AD的病理機(jī)制密切相關(guān)[4]。在AD中，此信號通路參與到Aβ依賴的神經(jīng)毒性作用中，纖維狀A(yù)β引起ERK1/2的激活，持續(xù)的激活又引起Tau蛋白的異常磷酸化，神經(jīng)進(jìn)行性的退行性變及細(xì)胞死亡[5]。

褪黑素(melatonin，MT)是松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，參與各種生理功能，對生物的晝夜節(jié)律、性成熟及生殖、衰老、免疫反應(yīng)、腫瘤、氧化應(yīng)激等均有調(diào)節(jié)作用。近年來，對于MT的研究領(lǐng)域頗為廣泛，其作為一種抗氧化和神經(jīng)保護(hù)因子，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用[6]。研究表明，MT通過調(diào)節(jié)多種信號通路如Notch1和Reelin[7-8]，分別在AD的海馬和皮層中發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。然而，MT對AD神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞機(jī)制研究仍然缺乏。有研究表明，在腦缺血/再灌注模型中，MT通過MEK/ERK1/2通路提供神經(jīng)保護(hù)作用[9]。本研究將進(jìn)一步探討MT是否通過MAPK/ERK通路，在AD中發(fā)揮對小腦的保護(hù)作用，為MT應(yīng)用于臨床提供一定的理論參考。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級8周齡SD♂大鼠32只，體質(zhì)量(220～260) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCKY(京)2012-0001，批號：11400700058126。將動物分組飼養(yǎng)在12 h光照/黑暗循環(huán)和溫控室中，并在開始實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)1周。

1.2藥物與試劑Aβ1-42(批號：A9810)、MT(批號：M5250)、GAPDH抗體(貨號：G9545)，均購自美國Sigma公司；HE染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司；NeuN(貨號：MAB377)，美國Millipore公司；Calbindin(貨號：108404)，美國Abcam公司；p-p44/42 MAPK(p-ERK1/2,貨號：4370)、p44/42 MAPK(ERK1/2,貨號：4696)，均購自美國Cell Signaling公司。

1.3儀器VT1200S振動切片機(jī)、4000b倒置顯微鏡(德國Leica公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；BioSpectrum 510全自動熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)；迷你臺式真空泵(中國其林貝爾公司)。

2 方法

2.1藥物儲存液的配制參考文獻(xiàn)[8]，將Aβ1-42肽以200 μmol·L-1溶解于無菌雙蒸水(DDW)中，并在37 ℃孵育24 h。以14 000 r·min-1、4 ℃離心10 min后，將可溶性Aβ1-42寡聚體立即儲存在4 ℃，并在24 h內(nèi)使用。在腦室內(nèi)(i.c.v.)顯微注射前，將Aβ1-42的儲備液在DDW中稀釋至終濃度80 μmol·L-1。將MT溶解于無水乙醇中，制備0.1 mol·L-1儲存溶液，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)進(jìn)一步稀釋至25 mmol·L-1用于腹膜內(nèi)(i.p.)注射。

2.2實(shí)驗(yàn)動物分組及動物模型的制備參考文獻(xiàn)[7]，用10%水合氯醛(300 mg·kg-1，i.p.)深度麻醉后，將大鼠置于立體定位儀中。切開的區(qū)域用75%乙醇消毒，并在顱骨左側(cè)鉆1個孔。根據(jù)Paxinos和Franklin(2000)的圖譜，將單管微量給藥導(dǎo)管(62001，中國瑞沃德)插入左側(cè)側(cè)腦室(坐標(biāo)：Bregma：AP=-0.7 mm，ML=+1.7 mm，DV=-4.0 mm)[10]。使用牙科水泥將其固定在顱骨，插入導(dǎo)管帽進(jìn)行密封，藥物注射時插入注射內(nèi)管。術(shù)后3 d，將大鼠隨機(jī)分為4組：對照組、Aβ1-42側(cè)腦室注射組(AD)、MT腹腔注射組(MT)、Aβ1-42側(cè)腦室注射結(jié)合MT腹腔注射組(AD+MT)。連續(xù)16 d，每天的13 ∶30～16 ∶00對MT組和AD+MT組腹腔注射1～2 mL的30 mg·kg-1MT，對照組腹腔注射PBS配制的25%乙醇。腹腔注射完成后，每隔1 d對AD組和AD+MT組給予5 μL的80 μmol·L-1Aβ1-42側(cè)腦室注射，同時對照組給予5 μL無菌DDW側(cè)腦室注射，共計(jì)8 d。手術(shù)動物常規(guī)術(shù)后處理，對所有動物保持室溫24 ℃，保證食物、水的充足。d 8開始進(jìn)行水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測不同處理組動物的學(xué)習(xí)、記憶功能，結(jié)果見文獻(xiàn)[8]。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動物小腦組織取材。

2.3組織切片的制備每組中任選3只大鼠，10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛緩沖液灌流，完成固定及后固定48 h以上，大腦經(jīng)30%蔗糖沉降48 h后，用振動切片機(jī)制備30 μm腦組織切片，置于含1%疊氮鈉的PBS緩沖液中，4 ℃保存，用于HE染色和免疫熒光染色。

2.4HE染色30 μm的組織切片貼于載玻片上，晾干后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察小腦皮層的組織結(jié)構(gòu)改變。

2.5免疫熒光染色檢測各組顆粒細(xì)胞標(biāo)記物NeuN、浦肯野細(xì)胞標(biāo)記物Calbindin和p-ERK1/2蛋白表達(dá)情況30 μm的組織切片用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，TBS 洗3遍，每次5 min。再用3% NDS+0.3% Triton X-100(用TBS稀釋)封閉，4 ℃孵育1 h，然后用3% NDS+0.3% Tween-20(用TBS稀釋)配制雜交液稀釋抗體，一抗NeuN(1 ∶1 000)、Calbindin(1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶800)，4 ℃孵育過夜。次日TBS洗3次后，加入二抗工作液(0.5%驢抗兔/鼠抗體+1.5% NDS，用TBS稀釋)，室溫孵育1 h，TBS洗3次，加入0.3% H2O2溶液，室溫孵育30 min。TBS洗3次。加入ABC液，室溫孵育90 min。TBS洗3次。滴加Cy3工作液(TSA buffer稀釋50倍)，迅速蓋上蓋玻片，室溫避光孵育10 min。洗去蓋玻片，TBS洗3次。DAPI復(fù)染10 min。TBS洗3次，晾干。封片后，顯微鏡下觀察、照相及分析。

2.6Westernblot檢測各組ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)各組造模完成后，分別任選3只大鼠麻醉后直接斷頭解剖，收集小腦組織于EP管中，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，制作樣品。抽提好的蛋白樣品進(jìn)行SDA-PAGE電泳，電泳完成后，將凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，350 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min。1% BSA封閉2 h，4 ℃孵育一抗過夜,復(fù)溫、漂洗一抗，然后37 ℃孵育二抗2 h,TBST漂洗后，ECL發(fā)光試劑顯影，分析各組p-ERK/ERK的表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠小腦皮層病理學(xué)變化如Fig 1所示，與對照組相比，AD組分子層(molecular layer，ML)變薄，顆粒細(xì)胞層(granule cell layer，GCL)細(xì)胞數(shù)減少。而AD+MT組分子層并未出現(xiàn)明顯的萎縮變薄，顆粒細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)也未出現(xiàn)明顯的減少。提示MT可以抵抗Aβ1-42對小腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用。

Fig 1 HE staining of cerebellar cortex in each group(×200)

A:Control group; B: AD group; C: MT group; D: AD+MT group. ML: Molecular layer; PL: Purkinje layer; GL: Granular layer

3.2各組大鼠小腦皮層顆粒細(xì)胞標(biāo)記物NeuN蛋白的表達(dá)情況如Fig 2所示，與對照組相比，AD組顆粒細(xì)胞層NeuN的熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.01)；與AD組相比，AD+MT組NeuN的熒光強(qiáng)度明顯上調(diào)(P<0.01)；對照組與MT組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示MT在不影響正常生理狀態(tài)小腦顆粒細(xì)胞的情況下，抑制Aβ1-42對小腦皮層顆粒細(xì)胞的損害作用。

3.3各組大鼠小腦皮層由Calbindin標(biāo)記的浦肯野細(xì)胞的個數(shù)變化如Fig 3所示，與對照組相比，AD組中浦肯野細(xì)胞的個數(shù)明顯減少(P<0.01)。AD+MT組與AD組相比，浦肯野細(xì)胞個數(shù)明顯增多(P<0.01)；對照組與MT組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示MT在不影響正常生理狀態(tài)小腦浦肯野細(xì)胞的情況下，阻止由Aβ1-42引起的小腦浦肯野細(xì)胞的減少。

Fig 2 Fluorescence level of NeuN in rat cerebellar cortex of each group(×200)

3.4MT對AD模型大鼠小腦組織ERK磷酸化水平的影響Fig 4的免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組比較，AD組中p-ERK的熒光強(qiáng)度明顯增加(P<0.01)；AD+MT組與AD組相比，熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.01)。Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，AD組中p-ERK1/ERK1的蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增加(P<0.01)；AD+MT組p-ERK1/ERK1的蛋白表達(dá)水平與AD組相比降低(P<0.01)，p-ERK2/ERK2在各組中的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示MT在一定程度上抑制了MAPK/ERK信號通路的激活。

Fig 3 Number of Purkinje cells in rat cerebellar cortex of each group(×200)

4 討論

AD是最常見的老年期癡呆類型，其臨床特征表現(xiàn)為隱襲起病、進(jìn)行性的記憶和認(rèn)知功能減退，多伴有人格、精神異常，是年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[11]。關(guān)于AD的研究主要集中在大腦半球的海馬和皮層的病理學(xué)改變，小腦的改變總是被忽略。但解剖學(xué)、臨床和神經(jīng)影像學(xué)方面的研究提示，AD患者的小腦在神經(jīng)功能和組織學(xué)方面也伴隨改變，這些改變主要是小腦灰質(zhì)體積的縮小、重量的減輕、浦肯野細(xì)胞的減少、分子層的萎縮和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生[3]。在AD患者的小腦中，Aβ1-42的含量也較對照組高出2倍之多[12]。越來越多的證據(jù)表明，可溶性Aβ1-42在AD的病理學(xué)改變中發(fā)揮重要作用，而且被認(rèn)為是AD發(fā)生和發(fā)展的扳機(jī)點(diǎn)。Aβ可以和腦內(nèi)過氧化氫酶相互作用，損傷其清除H2O2的能力，引發(fā)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或DNA的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和神經(jīng)元死亡[13]。

Fig 4 Fluorescence level of p-ERK in rat cerebellar cortex of each group(×200)

MT作為一種多功能的神經(jīng)激素，在AD中具有各種保護(hù)作用，除了能對抗Aβ 引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷,有效保護(hù)神經(jīng)元。同時，MT通過調(diào)節(jié)Aβ前體蛋白的代謝，抑制β 折疊，使β折疊結(jié)構(gòu)變成無規(guī)則線圈樣結(jié)構(gòu)，易于被機(jī)體清除，阻止可溶性的Aβ聚集成具有神經(jīng)毒性的纖維狀態(tài)，而且還具有抗炎和調(diào)節(jié)線粒體功能的作用。因此，MT是一種有潛力的AD預(yù)防和治療的藥物。本實(shí)驗(yàn)的HE染色結(jié)果顯示，AD組小腦的分子層萎縮變薄，細(xì)胞數(shù)減少，顆粒細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)也減少，而AD+MT組并未出現(xiàn)明顯的組織學(xué)改變。免疫熒光NeuN、Calbindin的結(jié)果顯示，AD組小腦皮層顆粒細(xì)胞及浦肯野細(xì)胞與對照組相比均減少，AD+MT組與對照組及MT組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時Calbindin免疫熒光也顯示，AD組的浦肯野細(xì)胞胞體縮小、變形。這些結(jié)果提示，提前給予MT可以有效阻止Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，抑制小腦皮層的萎縮，顆粒細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞數(shù)的減少及浦肯野細(xì)胞胞體的縮小變形，發(fā)揮對小腦皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用，與已知文獻(xiàn)結(jié)果一致[6]。

Fig 5 Relative expression of p-ERK/ERK in rat cerebellum of each

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAD group

MAPK通路是細(xì)胞外信號引起核反應(yīng)的細(xì)胞信息傳遞的匯聚通路之一，p38、JNK和ERK被認(rèn)為是MAPK信號傳導(dǎo)途徑的3個關(guān)鍵組成部分。活化的MAPK信號通路與AD的致病機(jī)制密切相關(guān)，Aβ引起的各種MAPK磷酸化狀態(tài)，導(dǎo)致突觸功能障礙、認(rèn)知能力的下降、氧化反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及凋亡過程。在AD中，纖維狀 Aβ1-42可誘導(dǎo)ERK激活，ERK1/2信號通路的持續(xù)激活，引起caspase-3以劑量和時間依賴性激活，導(dǎo)致Tau的異常磷酸化、營養(yǎng)不良神經(jīng)突的產(chǎn)生和進(jìn)行性神經(jīng)元變性；給予MEK-ERK1/2抑制劑后，明顯減弱了 Aβ1-42低聚物誘導(dǎo)的毒性作用，同時ERK1/2和caspase-3的活化降到較低的水平。抑制ERK的激活，還可使線粒體的裂變與融合達(dá)到平衡，防止線粒體形態(tài)和功能的異常，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)[14]。MT作為強(qiáng)效的抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)因子，在創(chuàng)傷性腦損傷中，抑制ERK1/2信號通路激活，并抑制急性期神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦組織，避免繼發(fā)性損傷。在本次實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光的結(jié)果提示，MT可以抑制ERK的激活，阻止Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用。另有一些文獻(xiàn)表明，Aβ通過下調(diào)ERK的激活，產(chǎn)生神經(jīng)損害作用。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，ERK在AD患者和AD動物模型的不同時期，其mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量不相同。ERK主要存在于細(xì)胞樹突、軸突及活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。在AD早期，星形膠質(zhì)細(xì)胞中ERK廣泛活化。相對于正常對照和疾病早期,在晚期階段(盡管在星形膠質(zhì)細(xì)胞中一些ERK仍然存在)，神經(jīng)元細(xì)胞體和營養(yǎng)不良神經(jīng)突中的ERK激活被抑制。因此，ERK的高或低活化，均可能有助于疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的Western blot結(jié)果提示，AD組的ERK1磷酸化水平明顯升高，與AD組相比，AD+MT組的ERK1磷酸化水平明顯下降，ERK2的磷酸化水平在各組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明MT可能是通過抑制ERK1的激活，發(fā)揮對小腦的保護(hù)作用。目前關(guān)于ERK1和ERK2的研究甚少，它們分別在信號級聯(lián)中的作用及其間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MT可以保護(hù)小腦免受Aβ1-42介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用，其機(jī)制可能與抑制MAPK/ERK信號通路相關(guān)，為臨床應(yīng)用MT預(yù)防及治療神經(jīng)退行性疾病提供了必要的理論基礎(chǔ)。