用Micro CT評價D-半乳糖致雄性小鼠骨質疏松模型及骨化三醇的防治作用

梁美婷，呂思敏，王可欣，許碧蓮，吳 鐵,

(1. 廣東醫科大學藥學院藥理教研室，廣東 湛江 524023；2. 廣東醫科大學·廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯合研究中心，廣東 東莞 523808)

骨質疏松是由多種因素導致的骨密度、骨性能質量下降，骨脆性增加，骨組織結構遭到破壞的一種代謝性骨病變[1]。據流行病學調查發現[2-3]，國內(60～70)歲老年人群中，大約有1/3者存在骨質疏松，在絕經后婦女中更常見，但男性骨質疏松癥也不容忽視，我國流行病學資料顯示，男性骨質疏松的患病率為5.5%～15.5%。研究顯示[4-5]，50歲以上的男性每年平均丟失大約0.2%～0.5%的骨量，且男性骨質疏松發生骨折意外后，其危害遠遠大于女性，即使經過傳統骨質疏松療法治療后，男性的骨性能康復結果及恢復正常生活的能力明顯差于女性。目前，男性骨質疏松動物模型通常采用去睪丸大鼠、小鼠進行造模。但是采用大鼠、小鼠去睪丸所造成的老年男性骨質疏松模型夾雜著心理與生理創傷的影響因素，不能很好地模擬老年男性骨質疏松的正常生理狀態[6-7]。本課題前期利用D-半乳糖建立了♂大鼠老年性骨質疏松模型[8-9]，但是D-半乳糖是否能導致♂小鼠發生老年骨質疏松，尚未研究。因此，本研究通過Micro CT探討D-半乳糖致♂小鼠老年骨質疏松模型的建立。骨化三醇屬于骨形成促進藥，臨床上常用于防治絕經后女性骨質疏松。但是骨化三醇用于老年男性骨質疏松的防治研究尚少。因此，本研究通過Micro CT等方法，在微觀結構上觀察骨化三醇對老年男性骨質疏松的影響，為男性骨質疏松的用藥治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物17周齡SPF級♂昆明小鼠30只，體質量(35～40) g，普通級動物飼養房內飼養，動物在實驗前適應周圍環境1周，普通顆粒維持飼料喂養，飲用過濾后清潔自來水，每籠10只。小鼠購自南方醫科大學動物中心，合格證號：SYXK(粵)2015-0147。

1.2藥物與試劑骨化三醇，購于Hoffmann-La Roche AG，批號：B2166B05。D-半乳糖，購于索萊寶，批號：923C057。

1.3儀器Viva Micro CT 40(SCANCO Medical AG)；AE240電子天平(梅特勒·托利多儀器公司上海分公司)；數控超聲波清洗器KQ-250DE(昆山超聲儀器有限公司)；858 Mini Bionix型材料測試系統(美國MST公司)。

1.4實驗動物的分組與給藥取上述小鼠，根據體質量按隨機區組法即配伍分組法原則，先將動物區分為若干個區組，然后將各區組通過Excel軟件的隨機函數Rand平均分配到3組，每組10只，具體為：① 正常對照組：灌胃給予生理鹽水，并背部注射生理鹽水；② D-半乳糖模型組：按150 mg·kg-1·d-1，每天背部皮下注射D-半乳糖(用生理鹽水溶解D-半乳糖，濃度為0.083 mol·L-1)，并灌胃給予生理鹽水，連續12周；③ 骨化三醇組：造模方法同模型組，然后按0.076 μg·kg-1·d-1灌胃骨化三醇混懸液(0.25 μg骨化三醇配成33.3 mL的混懸液)。所有小鼠于適應性喂養1周后開始給藥，連續給藥12周。7 d稱體質量1次，并按體質量變化調整給藥量，實驗過程中觀察小鼠的生存活動情況并記錄。實驗結束時，采用眼球取血處死小鼠。取雙側股骨做Micro CT掃描以及生物力學三點彎曲實驗[9]。

1.5觀察指標及測定方法

1.5.1小鼠體質量的觀察 7 d稱小鼠體質量1次，實驗第12周，在取材前12 h撤掉飼料，禁食不禁水，取材前稱重，作為實驗結束時的最終體質量。

1.5.2Micro CT對小鼠股骨的分析 將小鼠股骨附著組織剔除干凈，放入Micro CT儀，對左股骨干骺端進行X射線掃描。viva CT40選擇掃描參數:能量/強度為70 kVP，114 μA，8 W，掃描時間為29.7 min，片數Slice為505。掃描完成后，選取距生長板遠端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區域(region of interest,ROI)行三維重建，以最低閾值為150提取圖像信息。使用其軟件(SCANCO Medical AG)進行重建定量分析。參數如下：連接密度(connectivity density, Conn.D.)、結構模型指數(structure model index,SMI)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨體積分數(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)。

1.5.3小鼠股骨的生物力學分析 測試時，將在70%乙醇中保存的右股骨，用紗布吸干液體，進行預實驗，調試完畢可進行正式實驗。實驗時，用858 Mini Bionix型材料測試系統進行三點彎曲實驗，分析左側股骨的的生物力學性能。把小鼠股骨放在MTS實驗機上，加載速度為0.155 mm·s-1，跨距5 mm。繪制應力-應變曲線，從曲線上讀取數據，根據相應的公式計算參數指標：最大載荷(maximum load)、斷裂載荷(break load)、彈性載荷(elastic load)、剛度(stiffness) 等。

2 結果

2.1各實驗組小鼠體質量的變化實驗前，各組間小鼠體質量差異無統計學意義(P>0.05)。實驗后，不同時間點及結束時，各組間小鼠體質量差異仍無統計學意義(P>0.05)。見Tab 1。

2.2各組小鼠股骨遠端松質骨MicroCT二維圖(2D)和三維圖(3D)結果觀察Fig 1為各組小鼠股骨Micro CT的2D圖和3D圖。SEG(Segmented)圖反映骨小梁的數量，TH(Trabecular thickness)圖反映骨小梁的厚度分布情況，顏色從綠到紅，反映骨骨小梁從薄到厚；二維圖(2D image)可見骨髓腔內骨小梁數量。從圖中可見，正常對照組小鼠股骨骨小梁較粗，空隙較小，數量較多，連續性較好；模型組小鼠股骨出現了骨小梁的斷裂、變短、網狀結構退化，而且在中央還出現較大的空隙。骨化三醇組小鼠股骨的骨小梁之間的空隙較小，且均勻、有序、緊密，連續性較好，且與正常對照組比較差異無顯著性。

2.3各實驗組小鼠股骨MicroCT掃描指標的變化Tab 2記錄了各實驗組小鼠股骨Micro CT掃描參數的變化情況。從結果可見，與正常對照組相比，模型組股骨Micro CT指標的Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N均降低(P<0.05)，SMI增加(P<0.05)。與模型組相比，骨化三醇組股骨Micro CT指標的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加(P<0.05)，而SMI降低(P<0.05)。

2.4各實驗組小鼠股骨生物力學指標的變化Tab 3結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠股骨生物力學參數彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、有下降趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)。骨化三醇組股骨生物力學參數斷裂載荷、最大載荷、剛性系數均增加(P<0.05)，說明骨化三醇可明顯增加♂老年小鼠的股骨生物力學性能。與模型組比較，骨化三醇組斷裂載荷、彈性載荷、最大載荷和剛性系數均增加，說明骨化三醇可明顯增加D-半乳糖♂老年小鼠的股骨生物力學性能。

Tab 1 Body weight changes of mice in each experimental

Fig 1 2D reconstruction of Micro CT and ROI region 3D reconstruction of mouse femur

Tab 2 Changes of Micro CT scanning

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group

Tab 3 Changes of bio-mechanical properties in

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

3 討論

本實驗發現，在實驗結束時，D-半乳糖小鼠體質量與模型組差異無統計學意義，說明D-半乳糖對小鼠體質量無明顯影響。從結果可見，與正常對照組相比，模型組股骨Micro CT指標的Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N分別降低了68.08%、71.89%、61.54%和58.87%，而SMI上升39.34%，說明D-半乳糖可以降低正常生長♂小鼠股骨的骨密度，并使骨小梁由桿狀結構轉變為板狀結構，使骨微結構受到破壞。小鼠股骨Micro CT的ROI區三維重建圖中，模型組出現了骨小梁斷裂，變短，網狀結構退化，而且在中央還出現較大的間隙，這表明♂小鼠給予D-半乳糖12周后，小鼠股骨的骨量明顯減少，骨微觀結構受到破壞。與正常對照組比較，模型組小鼠股骨生物力學參數彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷有下降趨勢，但均無統計學差異，說明D-半乳糖對♂小鼠股骨生物力學性能影響不大。D-半乳糖引起衰老的原因與機體新陳代謝障礙問題相關聯，如果在一定時間內，連續給予動物注射一定量的D-半乳糖，短期內可使機體細胞內半乳糖濃度迅速增高，在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，后者不能被細胞進一步代謝而蓄積在細胞內，影響細胞的正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙，最終引起衰老。D-半乳糖引起小鼠骨質疏松癥的機制也類似衰老機制，由于皮下大劑量注射D-半乳糖，可在小鼠體內經氧化酶分解為CO2和木酮糖，并伴有大量氧自由基和H2O2的產生，若體內大量蓄積的過氧化物不能及時清除，則導致各種細胞的氧化損傷，影響了骨細胞的正常代謝，使骨的微觀結構出現缺陷，并影響到骨的生物力學功能，從而造成低轉換型的骨質疏松。男性骨質疏松多屬于低轉換型，實驗結果說明，皮下注射D-半乳糖可建立♂小鼠低轉換型骨質疏松模型。

本研究還發現，與模型組相比，骨化三醇組股骨Micro CT指標的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th分別增加4.39倍、2.56倍、1.52倍和0.38倍，而SMI降低了30.98%，表明骨化三醇可以明顯改善D-半乳糖♂衰老小鼠骨丟失的情況，使骨小梁結構由板狀轉變為桿狀，預防骨小梁微觀結構的損傷。小鼠股骨Micro CT的ROI區三維重建圖中，骨化三醇組的骨小梁間隙較小，連續性較好，排列均勻、有序、緊密。以上結果表明，骨化三醇可增加D-半乳糖♂老年小鼠股骨的骨量，微觀結構得到改善。因為骨化三醇具有明顯增加D-半乳糖♂小鼠股骨的骨量，從而使得D-半乳糖♂小鼠股骨生物力學性能指標得到改善。與正常對照組相比，骨化三醇組股骨Tb.Th明顯增加，說明骨化三醇還可以使♂小鼠股骨的骨小梁厚度超過正常生長的小鼠，具有明顯的改善骨微觀結構的作用。與正常對照組相比，骨化三醇組的斷裂載荷、最大載荷、剛性系數分別上升43.23%、42.69%、43.89%。與模型組比較，骨化三醇組的斷裂載荷、彈性載荷、最大載荷和剛性系數分別上升58.84%、53.27%、36.02%和36.10%，說明骨化三醇可明顯增加正常小鼠和D-半乳糖♂小鼠的股骨生物力學性能。臨床藥理學研究發現，小劑量活性維生素D3可促進腸道鈣的吸收、成骨細胞活性，以及抑制骨細胞活性，臨床主要用于婦女絕經后骨質疏松癥。骨化三醇是維生素D3的最重要活性代謝產物之一，在調節鈣平衡方面發揮著非常重要的作用，可促進骨鹽沉著及骨樣組織成熟，加快骨質的新陳代謝，促進新骨的形成，有效增加骨密度[10-11]。骨化三醇可抑制吸收亢進，促進腸鈣吸收，對膠原分解形成抑制，可在一定程度上減輕骨質疏松性骨痛[12]。有報道[13-14]，骨化三醇除具有傳統觀點上升高血鈣、改善骨形成的作用外，還具有免疫調節的功能。活性維生素D3對骨質疏松的臨床研究大多以絕經后婦女居多，對男性骨質疏松患者的研究報道還不多[15]。本研究結果為應用骨化三醇防治男性骨質疏松提供實驗依據，并為解決男性骨質疏松的治療難題提供可應用的治療藥物參考依據。