疲勞性亞健康對小鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏的影響

楊沅君，祁小術(shù)，張冬冬，趙永昌，殷羅悅，李 倩，張?jiān)伱?/p>

(徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

亞健康是指人體處于健康和疾病之間的狀態(tài)，已成為公共衛(wèi)生的重要問題之一。疲勞是其最常見的臨床表現(xiàn)，因而疲勞性亞健康是亞健康的主要類型[1]。疲勞性亞健康是指以疲勞為主要表現(xiàn)，持續(xù)或反復(fù)發(fā)作達(dá)3個(gè)月，并排除其他如癌癥、抑郁癥等可能使機(jī)體疲勞的疾病，表現(xiàn)為處于生理性和病理性的中間狀態(tài)。目前認(rèn)為，此種狀態(tài)的發(fā)生與工作生活失衡、心理壓力大和生活方式不良等多種因素有關(guān)，可表現(xiàn)出失眠多夢、精力不足、情緒紊亂等，嚴(yán)重影響個(gè)體的生活質(zhì)量與工作狀態(tài)[2]。

疼痛與許多遞質(zhì)有關(guān)。作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛信息調(diào)制過程中起著重要作用。研究表明，5-羥色胺2 A受體參與疼痛的發(fā)生、發(fā)展[3]；糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇(glucocorticoid, GC)可以通過減少與痛覺信息傳遞相關(guān)的神經(jīng)肽，抑制痛覺信息傳遞，從而起到鎮(zhèn)痛、提升痛閾的作用[4]；Kim等[5]發(fā)現(xiàn)，通過移除一種產(chǎn)生多巴胺(dopamine, DA)的A 11神經(jīng)元，慢性疼痛會明顯減輕，說明了DA可以促進(jìn)慢性疼痛。而疲勞狀態(tài)會引起這些與疼痛有關(guān)的遞質(zhì)發(fā)生一定變化：5-HT含量明顯增高；下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)，直接促使GC含量增高；DA含量明顯降低[6]。綜上所述，在疲勞性亞健康狀態(tài)下，遞質(zhì)的變化可以影響機(jī)體的疼痛敏感性，但缺乏具體定論。本研究采用疲勞性亞健康小鼠為實(shí)驗(yàn)動物模型，通過動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察疲勞性亞健康對機(jī)械痛敏和熱痛敏的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 清潔昆明種小鼠40只，♀♂不拘，體質(zhì)量(25±5)g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2015-0009。

1.1.2儀器 YSL-500疲勞轉(zhuǎn)棒儀(上海軟隆公司)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療公司)；Von Frey測痛毛刷(West Coast公司)；IITC series8型熱輻射刺激儀(美國IITC公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與疲勞性亞健康模型的制備隨機(jī)將小鼠分為2組，正常對照組(control組)和疲勞性亞健康組(fatigue組)，每組10只。為避免相互影響，分批次測定小鼠機(jī)械縮足反射閾值(paw withdrawal mechanical threshold, PWMT)與熱縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency, PWTL)。采用小鼠水中站立的方法，強(qiáng)迫疲勞性亞健康組小鼠在水中連續(xù)站立9 d，每天8 h，建立疲勞性亞健康模型[7]。

1.3生理狀態(tài)觀察模型建立前(d 0)、模型建立完成(d 9)以及恢復(fù)1 周后(d 16)，觀察小鼠皮毛光澤與情緒狀態(tài)。

1.4轉(zhuǎn)棒運(yùn)動功能實(shí)驗(yàn)(Rota-rodtest) d 0、9、16時(shí)，分別將小鼠放置于疲勞棒上，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)棒速度為40周/分，測定小鼠跌落或被動連續(xù)旋轉(zhuǎn)2周的時(shí)間，每只實(shí)驗(yàn)動物重復(fù)3次，每次間隔5 min，取平均值為結(jié)果。測試前，小鼠提前3 d以10周/分進(jìn)行運(yùn)動適應(yīng)訓(xùn)練，每天20 min[8]。

1.5血常規(guī)檢查模型建立完成后，各組小鼠尾靜脈采血，檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板數(shù)(PLT)、血小板平均體積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)、血小板壓積(PCT)等指標(biāo)。

1.6小鼠疼痛行為學(xué)測定

1.6.1PWMT的測定 d 0、9、16時(shí)，通過粗細(xì)不同的Von Frey細(xì)絲，根據(jù)Chen等[9]描述的方法，從0.16 g Von Frey探針開始，垂直刺激小鼠的右后足底。當(dāng)小鼠受刺激出現(xiàn)縮足、抬腿，記做1次陽性反應(yīng)。每組測量5次，當(dāng)出現(xiàn)3次及以上陽性反應(yīng)記做X，下一組測試更換為相鄰細(xì)的Von Frey細(xì)絲，陽性反應(yīng)出現(xiàn)小于3次記做O，下一組測試更換為相鄰粗的細(xì)絲，完成各組測試后，根據(jù)公式得出陽性反應(yīng)克數(shù)，為小鼠的PWMT。

1.6.2PWTL的測定 d 0、9、16時(shí)，用熱痛刺激儀照射小鼠后足部，記錄小鼠出現(xiàn)縮足回避時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中保持熱刺激強(qiáng)度不變，為防止對小鼠足底的損傷，設(shè)定截止時(shí)間為30 s，同側(cè)足底照射間隔10 min。每只小鼠測5次，去掉最大值和最小值，計(jì)算3次的平均值為PWTL[10]。

2 結(jié)果

2.1小鼠生理狀態(tài)變化d 0兩組小鼠皮毛亮白，行為自如，情緒正常。d 9發(fā)現(xiàn)疲勞性亞健康組小鼠皮毛暗淡，情緒明顯焦躁，易怒。d 16發(fā)現(xiàn)疲勞性亞健康組小鼠皮毛光亮，情緒平穩(wěn)，與實(shí)驗(yàn)d 1無異；正常對照組小鼠行為情緒正常。

2.2疲勞性亞健康對小鼠轉(zhuǎn)棒運(yùn)動功能的影響如Fig 1所示，d 0、16時(shí)，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間無明顯差異；d 9時(shí)，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間明顯縮短(P<0.01)，提示疲勞性亞健康組小鼠疲勞程度增加。

2.3疲勞性亞健康對小鼠血常規(guī)的影響Tab 1結(jié)果顯示，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)均無明顯異常，即非疾病狀態(tài)。

Tab 1 Effects of fatigue-predominant subhealth on blood routine indicators in n=10)

Fig 1 Effects of fatigue-predominant subhealth

**P<0.01vscontrol group

2.4疲勞性亞健康對小鼠PWMT的影響Fig 2結(jié)果顯示，d 0、16時(shí)，與正常對照組相比，PWMT數(shù)值無明顯差異；d 9時(shí)，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠PWMT明顯增加(P<0.01)，提示疲勞性亞健康組小鼠機(jī)械痛敏明顯降低。

Fig 2 Effects of fatigue-predominant subhealth

**P<0.01vscontrol group

2.5疲勞性亞健康對小鼠PWTL的影響Fig 3結(jié)果顯示，d 0、16時(shí)，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠PWTL數(shù)值無明顯差異；d 9時(shí)，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠PWTL明顯降低(P<0.01)，提示疲勞性亞健康組小鼠熱痛敏增加。

Fig 3 Effects of fatigue-predominant subhealth

**P<0.01vscontrol group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠水中站立的方法，強(qiáng)迫疲勞性亞健康組小鼠在水中連續(xù)站立9 d，每天8 h，建立疲勞性亞健康模型。簡便地模擬了疲勞性亞健康狀態(tài)下機(jī)體生物節(jié)律改變、精力不足等形成因素。我們發(fā)現(xiàn)，與正常對照組小鼠相比，可見疲勞性亞健康組小鼠皮毛暗淡、情緒焦躁。模型建立完成后，疲勞性亞健康組小鼠疲勞程度與正常對照組有明顯差異，而血常規(guī)檢查顯示，小鼠WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、PLT、MPV、PDW、PCT各項(xiàng)指標(biāo)均正常。提示機(jī)體處于疲勞但仍健康的狀態(tài)，符合對疲勞性亞健康的定義，表明本實(shí)驗(yàn)的疲勞性亞健康模型建立成功。

本實(shí)驗(yàn)測定PWMT和PWTL，通過小鼠耐受Von Frey纖維所致機(jī)械痛而產(chǎn)生不同的縮足時(shí)間，以及耐受同一光強(qiáng)所致熱痛而產(chǎn)生不同的縮足時(shí)間，客觀地反映實(shí)驗(yàn)對象的機(jī)械痛敏和熱痛敏，同時(shí)，分批次檢測以避免機(jī)械痛與熱痛測定過程中的相互影響。結(jié)果顯示，疲勞性亞健康組與正常對照組小鼠PWMT、PWTL基礎(chǔ)值無明顯差異，在模型建立成功后，疲勞性亞健康組小鼠PWMT明顯高于正常對照組，而PWTL明顯低于正常對照組。提示疲勞性亞健康組小鼠機(jī)械痛閾值升高，而熱痛閾值降低，可以認(rèn)為疲勞性亞健康使得機(jī)體機(jī)械痛敏降低，而熱痛敏增高。同時(shí)，d 16時(shí)，即停止造模1周后，與正常對照組相比，疲勞性亞健康組小鼠PWMT和PWTL無明顯異常，提示機(jī)械痛敏和熱痛敏恢復(fù)正常，表明疲勞性亞健康可以通過1周恢復(fù)為正常狀態(tài)，與已知研究結(jié)果相符[11]。

對于機(jī)械痛敏與熱痛敏變化不同步的情況，Robson等[12]研究發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉使熱痛閾值升高的同時(shí)，會通過降低脛骨的壓力使機(jī)械痛閾值降低，由此提出熱刺激與脛骨壓力所誘發(fā)的疼痛神經(jīng)起源不同。同時(shí)，近年也有實(shí)驗(yàn)證明，在切口痛中，嗎啡可使機(jī)械痛敏增加，而熱痛敏無變化[13]。綜合考慮現(xiàn)實(shí)情況，提出幾種假設(shè)：一方面，疲勞性亞健康模型和其他的疼痛模型相比，可能導(dǎo)致了機(jī)體內(nèi)5-HT、DA等多種遞質(zhì)共同作用，較為復(fù)雜多樣，因此造成機(jī)械性刺激和熱刺激不同的痛反應(yīng)；另一方面，脊髓背角神經(jīng)元存在著不同閾值的神經(jīng)元，會對觸壓刺激和熱刺激產(chǎn)生不一樣的反應(yīng)，從而產(chǎn)生不同的行為學(xué)結(jié)果。另外，疲勞性亞健康可能影響了機(jī)械痛和熱痛相關(guān)的不同通路，如分別對小鼠的機(jī)械痛和熱痛的傳導(dǎo)有著重要作用的酸敏感離子通道亞基3[14]和香草酸瞬時(shí)受體亞型Ⅰ基因[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的具體原因與作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究來確定。

實(shí)驗(yàn)表明，疲勞性亞健康狀態(tài)影響機(jī)體疼痛敏感性，使得對機(jī)械痛的敏感性降低，而對熱痛的敏感性增高，提示在現(xiàn)代生活中，不良的生活方式、較大工作壓力等所致的疲勞性亞健康雖非疾病狀態(tài)，但能夠通過改變對疼痛的敏感等，進(jìn)一步降低個(gè)體的生活質(zhì)量。同時(shí)，研究結(jié)果支持在一定時(shí)間內(nèi)，疲勞性亞健康可以恢復(fù)為健康狀態(tài)，為臨床診治提供一定的指導(dǎo)意義。