α-硫辛酸抑制炎癥信號TLR4和NLRP3的活化在糖尿病大鼠腎組織纖維化中的保護(hù)作用

肖 瑛, 袁質(zhì)平, 彭 燦, 張小歡,張瑩瑩, 王圓圓, 石明雋,張 帆, 孫 蘭, 郭 兵

(貴州醫(yī)科大學(xué)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室、2. 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 大學(xué)城醫(yī)院五官科，貴州 貴陽 550025)

臨床上，糖尿病(diabetes mellitus, DM)一旦引起腎臟損害，即使采取綜合治療，將血糖、血壓、血脂等指標(biāo)均控制在理想的范圍，亦不能完全阻止糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)病情的持續(xù)惡化，且DN發(fā)病隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)。最新研究發(fā)現(xiàn)，DN與發(fā)生在代謝紊亂與血流動(dòng)力學(xué)異常基礎(chǔ)上的炎癥反應(yīng)和激活的免疫系統(tǒng)關(guān)系密切。在各種炎癥因子相互影響和相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)起著中心調(diào)控作用。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是NF-κB上游信號調(diào)節(jié)因子，可激活多種細(xì)胞因子，最終引起一系列的免疫和炎癥反應(yīng)[1]。研究表明，TLR4和NF-κB作為炎癥反應(yīng)激活通路中的重要調(diào)節(jié)因子，在DN發(fā)展過程中的表達(dá)水平上調(diào)及過激化，可能是導(dǎo)致糖尿病腎損傷的重要機(jī)制之一[2-3]。也有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB可靶向激活含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3(NLR family pyrin domain containing 3, NLRP3)炎癥小體，從而誘導(dǎo)肝臟的炎癥反應(yīng)[4]。對DN患者的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞NLRP3表達(dá)與炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)水平、腎間質(zhì)損傷及腎功能改變明顯相關(guān)，提示NLRP3炎癥小體的激活參與DN腎小管氧化應(yīng)激損傷[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DN的發(fā)生發(fā)展過程與Notch有密切關(guān)系，Notch信號通路參與腎臟的發(fā)育、腎小球病變、腎小管間質(zhì)纖維化以及微血管病變，進(jìn)而影響DN的發(fā)生、發(fā)展。腎小管上皮細(xì)胞中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)加重腎小管外周炎性細(xì)胞的浸潤及促進(jìn)間質(zhì)纖維細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化[6]。但是DN腎小管間質(zhì)纖維化過程中，TLR4和NLRP3炎癥信號的活化是否受到Notch信號通路的調(diào)控，未見相關(guān)報(bào)道。

α-硫辛酸(alpha lipoic acid, ALA)是硫辛酸的氧化形式，能通過清除活性氧和自由基，減輕氧化應(yīng)激水平，現(xiàn)已用于臨床治療氧化應(yīng)激、糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥等有關(guān)疾病[7]。但是其對于DN抗炎抗纖維化保護(hù)作用的研究尚少。本研究從DN炎癥反應(yīng)所涉及的信號通路及其相互作用入手，通過ALA對腎組織Notch2、TLR4、NLRP3及炎性因子表達(dá)的影響，探討ALA改善DN炎癥反應(yīng)和纖維化程度的保護(hù)作用及機(jī)制，為尋找藥物治療的靶點(diǎn)提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，♂，體質(zhì)量(180±20) g，24只，清潔級，購于北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號為：SCXK(京)2009-0004。大鼠飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，常規(guī)飼料，自由飲水。

1.1.2藥物與試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ，美國Sigma公司)；ALA (中國奧立寶公司)；兔抗TLR4多克隆抗體(美國ProteinTech公司)；兔抗NLRP3多克隆抗體(中國博奧森生物有限公司)；兔抗Notch2多克隆抗體(中國MDL公司)；抗Ⅳ型膠原(collagen Ⅳ, Col-Ⅳ)蛋白單克隆抗體(美國Sigma公司)；抗β-actin抗體(武漢Boster公司)；總抗氧化物酶活性(total antioxidant capacity, T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒(南京建成公司)；免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)兩步法檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ELISA試劑盒(北京欣博盛生物技術(shù)公司)。

1.1.3儀器 血糖儀(美國強(qiáng)生有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(德國Bayer公司)；高速低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)；核酸蛋白分析儀、電泳系統(tǒng)及電泳移裝置(美國Amersham公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1糖尿病動(dòng)物模型的建立及分組 造模前4～6 h禁食不禁水，一次性尾靜脈注射STZ(55 mg·kg-1) 建立糖尿病大鼠模型。72 h后禁食4 h，尾靜脈尖部針刺取血測空腹血糖，血糖≥16.7 mmol·L-1且尿糖陽性為糖尿病模型成功[7]。成模2周后，隨機(jī)分為糖尿病組(DM組)、ALA組，每組8只，另設(shè)空白對照組(NC組)大鼠8只。ALA組每天以150 mg·kg-1灌胃給藥，連續(xù)6周。空白對照組和DM組給予等量等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間未使用胰島素，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)未發(fā)生動(dòng)物死亡。

1.2.2標(biāo)本收集及指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)8周末，收集大鼠24 h尿量，雙縮脲法測尿蛋白濃度，得到的尿蛋白濃度與24 h尿量乘積為24 h尿總蛋白量(24 h urine protein, 24 h UP)。然后，乙醚麻醉行股總動(dòng)脈采血，葡萄糖氧化酶法檢測大鼠血糖(blood glucose, BG)，酶分析法檢測血總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)。通過左心室注射4 ℃預(yù)冷的生理鹽水，反復(fù)灌洗腎臟后游離，固定于4%多聚甲醛，制成切片進(jìn)行免疫組化染色。0.1 g腎皮質(zhì)加入500 μL組織蛋白裂解液進(jìn)行腎組織勻漿，BCA法測定蛋白濃度，參照T-AOC和MDA試劑盒說明書，進(jìn)行測定。ELISA試劑盒檢測腎組織上清液中白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)含量。

1.2.3腎臟HE、Masson染色及免疫組織化學(xué)染色 取已固定的大鼠腎臟做成3 μm厚的石蠟切片，HE和Masson染色進(jìn)行病理學(xué)觀察。按免疫組化SP二步法進(jìn)行腎皮質(zhì)Notch2、NLRP3、TLR4(1 ∶50)染色，經(jīng)脫蠟、水化、微波爐加熱行抗原修復(fù)、抗體孵育，DAB溶液顯色，光鏡下觀察表達(dá)部位，并拍攝圖片。

1.2.4Western blot法檢測腎皮質(zhì)中Notch2、NLRP3、TLR4和Col-Ⅳ的蛋白表達(dá) 取各組大鼠腎皮質(zhì)0.1 g，加入500 μL組織蛋白裂解液進(jìn)行組織勻漿，離心后提取上清液，按BCA試劑盒說明書操作，檢測大鼠腎組織蛋白濃度。加入5×的上樣緩沖液，煮沸后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜后，分別孵育一抗β-actin(1 ∶4 000)、Notch2(1 ∶1 000)、NLRP3(1 ∶1 000)、TLR4(1 ∶1 000)和Col-Ⅳ(1 ∶1 000)，4 ℃過夜，二抗常溫孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光，經(jīng)Image Lab 5.1軟件處理并分析圖像。

2 結(jié)果

2.1ALA對DM大鼠生化指標(biāo)的影響由Tab 1可知，DM組大鼠的血糖、總膽固醇、甘油三酯和24 h尿蛋白量均明顯高于對照組(P<0.05)。給予ALA治療6周后，與DM組比較，除血糖沒有明顯降低外，總膽固醇、甘油三酯和24 h尿蛋白量均明顯低于DM組(P<0.05)，且伴隨大鼠多飲、多食、多尿現(xiàn)象有所改善。表明ALA可能通過降低血脂，減輕對腎臟的損害，從而減少尿蛋白。

Tab 1 Comparison of BG, 24 h UP, TC,TG levels among three

*P<0.05vsNC;#P<0.05vsDM

Fig 1 The pathological changes in tissues of three groups observed by HE and Masson(×200)

2.2ALA對DM大鼠氧化應(yīng)激水平的影響通過對T-AOC和MDA的檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，DM組T-AOC活性降低，MDA含量升高(P<0.05)；ALA治療后可明顯升高T-AOC活性，降低MDA含量(Tab 2)。表明ALA可減輕氧自由基對腎小球的損害，改善腎小球基底膜的通透性，從而減少尿蛋白。

Tab 2 Comparison of T-AOC and MDA levels among three

*P<0.05vsNC;#P<0.05vsDM

2.3大鼠腎臟組織的病理學(xué)變化對照組大鼠HE染色的腎組織中，腎小球輪廓清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整；DM組部分腎小管結(jié)構(gòu)破壞，上皮細(xì)胞有空泡樣變性，可見基底膜明顯增厚，而ALA組與DM組相比，腎小球和腎小管病變情況有不同程度的改善。與NC組相比，DM組腎小管間質(zhì)中Masson染色呈深藍(lán)色，陽性物質(zhì)明顯增多，而ALA組與DM組相比，可見腎小管間質(zhì)中深藍(lán)色陽性物質(zhì)較DM組明顯減少(Fig 1)。

2.4ALA對DM大鼠腎皮質(zhì)TLR4蛋白表達(dá)的影響免疫組化顯示，NC組大鼠的腎組織中TLR4表達(dá)量少，DM組可見TLR4表達(dá)明顯增多，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞中，呈棕黃色；在ALA組中，TLR4的表達(dá)較DM組明顯減少，顏色變淺。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM組較對照組TLR4表達(dá)明顯增加；ALA組與DM組相比，TLR4的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見Fig 2。

Fig2ComparisonofTLR4proteinexpressionamongthreegroups

2.5ALA對DM大鼠腎皮質(zhì)NLRP3蛋白表達(dá)的影響免疫組化染色可見，在對照組大鼠的腎組織中幾乎不表達(dá)NLRP3，但DM組可見NLRP3表達(dá)明顯增多，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞中，呈棕黃色；在ALA組中，NLRP3表達(dá)較DM組明顯減少，顏色變淺。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，DM組NLRP3表達(dá)明顯增加；與DM組相比，ALA組NLRP3的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 3。以上結(jié)果表明，ALA可以改善DM狀態(tài)下腎小管-間質(zhì)的炎癥反應(yīng)，從而延緩腎小管-間質(zhì)的損傷進(jìn)程。

Fig 3 Comparison of NLRP3 protein expression among three groups

2.5ALA對DM大鼠腎皮質(zhì)Notch2蛋白表達(dá)的影響免疫組化染色可見，在對照組大鼠的腎組織中，Notch2有少量的表達(dá)，而在DM組Notch2表達(dá)明顯增多，腎小球和腎小管均有表達(dá)，呈棕黃色；與DM組相比，ALM組Notch2表達(dá)明顯減少，顏色變淺。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，DM組Notch2表達(dá)明顯增加；與DM組相比，ALA組Notch2的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見Fig 4。結(jié)果表明，DM狀態(tài)下大鼠腎皮質(zhì)Notch2信號通路被激活，ALA可以抑制其激活。

Fig 4 Comparison of Notch2 protein expression among three groups

2.6ALA對DM大鼠腎皮質(zhì)Col-Ⅳ蛋白表達(dá)的影響Western blot評估DM大鼠腎皮質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的水平。與對照組比較，DM組大鼠腎皮質(zhì)中Col-Ⅳ表達(dá)增多(P<0.05)，給予ALA6周后，與DM組比較，ALA組大鼠腎皮質(zhì)Col-Ⅳ表達(dá)減少(P<0.05)，見Fig 5。此結(jié)果表明，ALA可以改善DM所致的大鼠腎纖維化。

2.7ALA對腎組織上清液中炎性因子含量的影響Tab 3 ELISA法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，DM組IL-6、TNF-α含量明顯增加(P<0.05)；與DM組相比，ALA組IL-6、TNF-α含量明顯下降(P<0.05)。

Tab 3 Comparison of IL-6 and TNF-α

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDM group

Fig 5 Comparison of Col-Ⅳ protein

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDM group

2.8相關(guān)性分析ALA組大鼠的腎組織中Notch2蛋白與TLR4蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.886(P<0.05)；Notch2蛋白和NLRP3蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.899(P<0.05)。

3 討論

硫辛酸是一種天然存在的化合物，其氧化形式為ALA，還原形式為二氫硫辛酸，兩種形式的硫辛酸都具有較強(qiáng)的抗氧化性。Cho等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在急性腎損傷時(shí)，ALA可阻止腎小管的凋亡、腎臟的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，而在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion, UUO)腎間質(zhì)纖維化腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)過程中，ALA可抑制巨噬細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，也可以通過減少基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，來減慢管基底膜的破壞速度，提示ALA在預(yù)防和治療慢性腎臟疾病的優(yōu)勢作用可進(jìn)行深入探索。在本實(shí)驗(yàn)中，ALA雖沒有降低血糖，但是降低血脂的作用減輕了脂血癥對腎臟的損害，從而減少24 h尿蛋白，還降低了DM狀態(tài)下腎組織中的氧化應(yīng)激水平，抑制炎性因子的分泌，減少了Col-Ⅳ蛋白表達(dá)，提示ALA通過抗炎、抗纖維化，發(fā)揮了對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。其作用是否能像二甲雙胍一樣[9]，通過抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抗炎癥、抗纖維化，來發(fā)揮非降糖的腎臟保護(hù)作用呢？值得深入研究。

DN發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，但它們的共同規(guī)律為：任何因素都要通過細(xì)胞內(nèi)的信號通路，將細(xì)胞外信息轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，引起細(xì)胞行為的改變。隨著研究的深入，確立了炎癥反應(yīng)在DN中的作用，認(rèn)為DN是一種自然免疫和慢性低度炎癥性疾病。基于此，探討炎癥反應(yīng)如何促進(jìn)DM腎臟纖維化的作用，逐漸受到重視。在DM大鼠腎臟，ALA抗炎抗纖維化的保護(hù)作用是如何發(fā)揮的呢？我們對能夠激活天然免疫細(xì)胞，最終導(dǎo)致一系列免疫炎癥反應(yīng)的天然免疫受體TLRs家族中的TLR4，以及和TLRs能夠相互影響，共同調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答的模式識別受體，如細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體(NOD-like receptors, NLRs)中研究最為廣泛的NLRP3炎癥小體，在糖尿病腎組織中的變化進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)下TLR4和NLRP3蛋白的表達(dá)都明顯增多，炎性因子IL-6和TNF-α分泌量增加，提示炎癥信號通路被激活，并參與了腎臟損害。這與Garibotto 等[10]研究結(jié)果一致。當(dāng)給予ALA治療后，TLR4和NLRP3蛋白的表達(dá)都明顯減少，炎性因子IL-6和TNF-α分泌量降低，表明ALA可能通過抑制TLR4和NLRP3的活化，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，但是其具體的調(diào)控機(jī)制不清楚。

Notch信號傳導(dǎo)通路在胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡、腫瘤發(fā)生發(fā)展、炎癥等生理病理過程中起重要作用。哺乳動(dòng)物中Notch有4種亞型，分別是Notch 1-4。經(jīng)典的Notch信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)是Notch受體胞外區(qū)與配體結(jié)合，被依賴于去整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease, ADAM)和分泌酶切割后，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain, NICD)釋放，NICD進(jìn)入細(xì)胞可引起Notch信號靶基因如Hes1的轉(zhuǎn)錄。近年來研究表明，TLR信號激動(dòng)劑能夠調(diào)整Notch受體和配體的表達(dá)，來增強(qiáng)TLR信號免疫應(yīng)答反應(yīng)，提示Notch信號與TLR介導(dǎo)的炎癥方面存在關(guān)聯(lián)[11-13]。但是未見Notch2與TLR4在DM腎組織中的表達(dá)關(guān)系，也未見Notch2與NLRP3在DM腎組織中的表達(dá)研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM組Notch2、TLR4、NLRP3表達(dá)均明顯增加，伴隨炎性因子的分泌增多、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積加重；給予ALA治療后，Notch2的表達(dá)明顯降低，并分別與TLR4、NLRP3表達(dá)減少呈明顯正相關(guān)，同時(shí)炎性因子和細(xì)胞外基質(zhì)分泌量明顯減少，提示ALA可能是通過抑制Notch2蛋白的表達(dá)，減輕DN炎癥反應(yīng)和纖維化病變的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮保護(hù)作用，但是具體的調(diào)控機(jī)制還需要在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中使用干預(yù)手段進(jìn)一步驗(yàn)證。