反式-茴香腦對疊氮鈉誘導的PC12細胞損傷的保護作用

何中洪，鄭 茜，魏 靜，杜 曦，郭 凱，張 春，王 欽

(西南醫科大學藥學院醫藥產業化研發中心，四川 瀘州 646000)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)等神經退行性疾病與腦內線粒體功能障礙密切相關[1-2]。有資料顯示，AD患者線粒體內線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ，即細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, COX)活性的減少較為明顯且特異。因此，有些學者推測，COX的抑制可能導致培養細胞內出現類似AD的病理改變。疊氮鈉(sodium azide, NaN3)是一種特異性COX抑制劑，它可以特異性抑制線粒體氧化磷酸化過程中的COX，造成細胞線粒體功能障礙，從而進一步導致細胞生命活動所需的ATP減少、自由基產生的增多、多種凋亡因子的釋放和細胞膜的損傷，最終導致一系列類似AD的病理改變。因此，NaN3可以通過損傷線粒體活性，建立具有部分類似AD、PD病理改變的動物和細胞模型[3]。PC12細胞株來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，具有神經內分泌細胞的一般特征，其穩定、生長迅速和不易發生自動轉化等優點，可建立能傳代的二倍體的細胞系，因其細胞結構、功能和形態類似于神經細胞，可作為體外研究神經性疾病的細胞模型[4]。

茴香廣泛用于食品香精和傳統藥物，其所含成分反式-茴香腦(trans-anethole, TA)具有多種多樣的生物活性。據報道，TA可以通過抑制細胞釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，實現抗炎作用[5-6]；通過有效抑制乙酰膽堿脂酶活性，起到抗氧化應激作用[7]；通過激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體，減輕細胞內鈣超載，進而明顯改善氧葡萄糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導的神經元損傷[8]。但TA的神經保護作用是否通過抑制線粒體損傷途徑而發揮，目前研究并未完善。本實驗以NaN3與PC12細胞共孵育，制備線粒體損傷模型，觀察TA對NaN3誘導的PC12細胞損傷的保護作用，為探討TA防治神經退行性疾病的作用及可能機制提供一定依據。

1 材料

1.1藥物與試劑TA(阿達瑪斯試劑，純度>98%)；NaN3(成都金山化學試劑有限公司)；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素(Bioder公司)；DMEM高糖培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器SW-CJ-1F型超凈工作臺(上海蘇凈實業有限公司)；HERA·Cell 150i型CO2培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；Spectra Max M3多功能酶標儀(美國Molecular Devices)；CKX53-SLP倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1PC12細胞的傳代培養PC12細胞購自中國科學院細胞庫(上海)。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3 d傳代1次，當細胞貼壁約80%時用于實驗。

2.2CCK-8法測定細胞存活率將細胞接種于96孔培養板(細胞接種密度為5×107·L-1)，生長至80%匯合時，棄去培養液，用PBS清洗1次，加入含7%濃度CCK-8工作液，37 ℃、5% CO2培養箱內孵育40 min。用全自動酶標儀在波長450 nm處測定其OD值。細胞存活率/%=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

2.3TA及NaN3對細胞的毒性考察選取對數生長期的PC12細胞，接種于96孔培養板(細胞接種密度為5×107·L-1)，生長至80%融合時加入藥物處理。處理分成溶劑對照組、TA處理組和NaN3處理組。TA處理組加入終濃度為10、30、60、100、150、200 μmol·L-1的TA，每個濃度設5個復孔；NaN3處理組加入終濃度為9、18、27、36、45、54 mmol·L-1的NaN3，每組5個復孔。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，采用CCK-8法測定細胞存活率。

2.4TA對NaN3誘導PC12細胞損傷的保護作用選取對數生長期的PC12細胞，接種于96孔培養板(細胞接種密度為5×107·L-1)，生長至80%融合時進行后續實驗。將細胞分成溶劑對照組、模型組、處理組。模型組加入一定濃度NaN3(對細胞損傷模型的有效濃度)；處理組預先加入TA(終濃度為10、30、60、100、150、200 μmol·L-1)，每個濃度設5個復孔，置于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養8、16、24 h后，棄培養液，加入含NaN3(對細胞損傷模型的有效濃度)繼續培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態學改變，采用CCK-8法測定細胞存活率。

2.5Hoechst33258染色觀察細胞凋亡取處于對數生長期的PC12細胞，接種于6孔培養板(細胞接種密度為5×107·L-1)，按照“2.4”項下方法處理細胞。培養結束，吸去培養液，95%乙醇固定10 min，PBS洗2次，每孔加入500 μL Hoechst 33258染色液，室溫避光染色5 min，PBS洗2次，用中性樹脂封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。鏡下隨機找到5個不重復區，計數200個細胞中凋亡細胞數。其中凋亡細胞所占百分比即為細胞凋亡率。

2.6細胞比色法測定細胞LDH、MDA及SOD活力根據細胞中LDH催化乳酸生成丙酮酸二硝基苯肼化合物，在堿性溶液里顯棕紅色，通過分光光度法，求出細胞上清液中LDH的含量。根據細胞中LDH的漏出量，可判斷細胞的受損程度。按照“2.4”處理細胞結束后，取細胞培養上清液，按照LDH試劑盒操作說明進行檢測和計算。2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氫-四唑鹽，二鈉鹽(WST-1)能與超氧陰離子(O2-)反應生成一種水溶性染料，WST-1與超氧陰離子還原反應的比率與黃嘌呤氧化酶的活性呈線性關系，且能被SOD抑制。因此，通過WST-1法可測定樣本中SOD含量。MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)在酸性和高溫條件下能發生縮合反應，生成紅棕色的三甲川(3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮)產物，其在532 nm處有最大吸收峰。通過TBA法可測定樣本中MDA的含量。消化收集各組細胞，每組加500 μL PBS使細胞重懸，采取反復凍融的方法(液氮5 s，-20 ℃冰箱30 s，室溫解凍，如此重復3次)裂解細胞，1 000 r·min-1離心8 min，取上清液，按照SOD、MDA試劑盒操作說明進行檢測和計算。將各組計算所得數據與正常組的數據的百分比值作為最終數值。

3 結果

3.1TA對PC12細胞存活率的影響Fig 1結果顯示，與對照組比較，TA從低濃度到高濃度處理PC12細胞48 h，對細胞存活率無明顯影響(P>0.05)，表明TA對PC12細胞基本無毒性。

Fig 1 Effect of TA on cell viability of PC12 n=5)

3.2NaN3誘導PC12細胞損傷模型的建立Fig 2結果顯示，與對照組比較，NaN3對PC12細胞損傷具有劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.01)。其中27 mmol·L-1NaN3培養24 h，細胞存活率約為50%。因此，27 mmol·L-1NaN3為細胞損傷模型的有效濃度。選用27 mmol·L-1NaN3作用PC12細胞24 h作為PC12細胞損傷模型。

Fig 2 Effect of NaN3 on cell viability of PC12 n=5)

**P<0.01vscontrol

3.3TA對NaN3誘導PC12細胞損傷的保護作用如Fig 3所示，不同濃度TA預處理8 h，TA(10、30、60 μmol·L-1)給藥組對NaN3誘導的PC12細胞損傷呈濃度依賴性的保護作用，即隨著TA濃度增加，其對PC12細胞的保護作用增強。60 μmol·L-1TA預處理8、16、24 h，均對NaN3導致的細胞損傷具有明顯的保護作用。

3.4TA對NaN3誘導PC12細胞損傷的形態學的影響如Fig 4所示，正常PC12細胞形態為梭形、小三角形等，各細胞間緊密接觸，成簇生長，且從細胞邊緣有突出的突起，相互交錯的突起形成網絡。模型組梭形細胞減少，細胞突起變短或者消失，部分細胞皺縮、變圓、脫落、漂浮于細胞培養液中，細胞出現明顯損傷形態。10、60 μmol·L-1TA預處理8 h，與模型組相比，均能改善NaN3誘導PC12細胞損傷的細胞形態。

3.5TA對NaN3誘導PC12細胞Hoechst33258染色的影響如Fig 5所示，Hoechst 33258染色后，對照組PC12細胞核呈現彌散均勻微弱的藍色熒光，表明其凋亡細胞少。模型組多數細胞呈現出較強的藍白色熒光，細胞核明顯變小，呈現不規則形狀，有些細胞內可見濃染致密的顆粒狀熒光，表明細胞凋亡數量明顯增多(P<0.05)。根據Hoechst 33258染色結果，計算細胞凋亡率，10、60 μmol·L-1的TA均能明顯減少NaN3誘導PC12細胞的凋亡。其中，60 μmol·L-1TA的保護作用最佳。

3.6TA對NaN3誘導PC12細胞損傷的LDH漏出量的影響細胞上清液中LDH水平反映了細胞的受損程度。NaN3損傷后，LDH漏出量明顯增加，而10、60 μmol·L-1TA預處理可明顯對抗NaN3誘導的PC12細胞內LDH的釋放，減輕細胞損傷。見Fig 6。

Fig 3 Effect of TA on PC12 cell injury

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsNaN3model

3.7TA對NaN3誘導PC12細胞損傷的SOD活力和MDA含量的影響如Fig 7所示，與對照組相比，模型組PC12細胞內SOD活力明顯降低(P<0.05)、MDA含量明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，10、60 μmol·L-1TA組均可明顯提高PC12細胞內SOD活力(P<0.05)，降低PC12細胞內MDA含量(P<0.05)，表明TA能提高細胞的抗氧化能力，減輕細胞氧化損傷。

Fig 4 Effect of TA on morphology of PC12 cell injury induced by NaN3(×400)

A:Control;B:NaN3(27 mmol·L-1);C:TA(10 μmol·L-1)+NaN3(27 mmol·L-1);D:TA(60 μmol·L-1)+NaN3(27 mmol·L-1)

Fig 5 Effect of TA on Hoechst 33258 staining of PC12 cell injury induced by NaN3(×100)

Fig 6 Effect of TA on LDH leakage of PC12 cell injury induced by n=5)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsNaN3model

Fig 7 Effect of TA on activity of SOD(A) and MDA(B) of PC12 cell injury induced by n=5)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsNaN3model

4 討論

中樞神經系統退行性疾病的發生與線粒體功能障礙密切相關，線粒體功能失調以及由線粒體介導的神經細胞凋亡，在退行性疾病的發生、發展中起了重要的作用。氧化應激是指活性氧生成與抗氧化防御系統之間的不平衡狀態，氧化應激可在活性氧生成超過抗氧化防御系統時，或者在抗氧化劑活性降低時發生。氧化應激能夠導致脂質過氧化、蛋白和DNA氧化和氧化還原態的改變，從而促進神經細胞凋亡[9-10]。SOD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子[11]，它能將對機體有害的氧自由基轉化成過氧化氫而被清除。MDA是脂質過氧化的產物之一[12]，它能影響線粒體呼吸鏈復合物和線粒體內關鍵酶的生物活性，它的產生還能加重細胞膜的損傷。因此，考察細胞中抗氧化酶活性及細胞膜脂質過氧化物的產生，可以了解細胞的損傷程度。本研究采用常用的NaN3致PC12細胞損傷模型，考察TA對PC12細胞損傷后的保護作用。實驗結果表明，經NaN3處理后，細胞內SOD活力降低，MDA含量升高。NaN3對PC12細胞的損傷呈劑量依賴性。TA對NaN3誘導PC12細胞損傷保護具有明顯的時效、量效關系。60 μmol·L-1TA能明顯改善PC12細胞形態，減少PC12細胞中LDH的漏出和凋亡細胞的數量，同時，可明顯抵抗由NaN3損傷造成的細胞SOD活力下降，降低MDA含量。表明TA能提高機體的抗氧化能力，抑制NaN3誘導的氧化應激，減輕細胞氧化損傷。

綜上所述，TA對NaN3損傷的PC12細胞具有明顯的保護作用，其機制可能是TA通過提高受損PC12細胞內抗氧化酶SOD活性，減少脂質過氧化產物MDA的生成，防止細胞膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸過氧化，維持細胞膜完整性。該結果提示，TA能夠拮抗AD等神經退行性疾病中的線粒體功能障礙，對此類疾病的治療具有一定的應用前景。