PM2.5中丙二醛的檢測、濃度特征及氧化損傷的研究

玉散·吐拉甫，迪麗努爾·塔力甫，蘇吾比努爾·熱克甫，圖爾貢·艾爾肯，阿布力克木·阿不力孜，買麗克扎提·買合木提，亞力昆江·吐爾遜，米吉提·依明

1.新疆大學(xué)，煤炭清潔轉(zhuǎn)化與化工過程自治區(qū)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046 2.和田地區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，新疆 和田 848000

PM2.5是重要的大氣污染物，因其在大氣中停留時間長，所負載的化學(xué)組分可以在大氣中發(fā)生一系列光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生毒性更大的產(chǎn)物[1]。有研究報道[2-3]，PM2.5的化學(xué)組成中有機物質(zhì)量分數(shù)高達50%。這些有機物中的不飽和脂肪酸在大氣中進一步氧化和分解，經(jīng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成醛類、酮類和酸類等小分子化合物[1]，其中脂質(zhì)過氧化物的重要代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)具有極強的生物活性，能夠破壞生物大分子，可以與蛋白質(zhì)或酶交聯(lián)成Schiff氏堿，使酶失活并導(dǎo)致機體DNA突變、細胞分裂異常[4-5]。研究表明，MDA含量與一些疾病(如慢性胃炎、動脈硬化等)有關(guān)聯(lián)作用[6]。通過PM2.5對動物染毒實驗來檢測細胞內(nèi)MDA含量研究表明，隨著PM2.5質(zhì)量濃度增加，細胞內(nèi)MDA濃度上升，細胞死亡率增大[7]。雖然對大氣有關(guān)的MDA已有研究，但大部分均集中在檢測動物細胞內(nèi)的MDA含量，對負載在PM2.5膜中MDA含量的測定還鮮見報道。

和田市位于塔克拉干沙漠和塔里木盆地邊緣，屬干旱荒漠性氣候，年均蒸發(fā)量(2 480 mm)與降水量(35 mm)比值高達70，風(fēng)沙較多，是中國沙塵暴災(zāi)害頻發(fā)區(qū)域之一。常年的沙塵暴導(dǎo)致和田地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)非常脆弱，大氣污染較為嚴重，經(jīng)常出現(xiàn)PM2.5質(zhì)量濃度爆表情況[8]。近年來，對和田市城區(qū)大氣污染物的研究日益增多，但其大部分研究周期較短，而且主要集中于和田市大氣顆粒物的粒徑分布、形貌特征和化學(xué)組成的研究[9-12]，對大氣顆粒物的毒性研究也偏重于問卷調(diào)查來分析沙塵暴發(fā)生時PM10質(zhì)量濃度與人群呼吸道和眼部不適癥狀發(fā)生率的相關(guān)性[13-14]，缺少對大氣PM2.5毒性的系統(tǒng)研究，關(guān)于PM2.5樣品膜中MDA質(zhì)量濃度的季節(jié)性分布及其對健康影響的研究也罕見報道。因此，研究和田市城區(qū)PM2.5膜中的MDA測定條件、質(zhì)量濃度變化特征以及MDA質(zhì)量濃度與PM2.5導(dǎo)致的DNA氧化性損傷之間的關(guān)系，對于了解當(dāng)?shù)豍M2.5毒性具有重要意義，能夠為PM2.5毒性評價和“一帶一路”倡議地段大氣污染研究提供科學(xué)依據(jù)。本研究以和田市城區(qū)2014年采集的大氣PM2.5樣品為實驗對象，將PM2.5樣品膜與2-硫代巴比妥酸和三氯乙酸混合顯色液反應(yīng)，用可見光分光光度計測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度，通過正交實驗來優(yōu)化PM2.5膜中MDA的提取及測定，并分析MDA質(zhì)量濃度季節(jié)性分布特征和毒性。

1 實驗部分

1.1 PM2.5樣品的采集

采樣點設(shè)在和田地區(qū)環(huán)保局(東經(jīng)79°30′，北緯37°06′)四樓樓頂，采樣高度為12 m，采樣點距和田市城區(qū)主干道500 m，附近沒有高層和污染源，該采樣點能夠代表和田市城區(qū)大氣污染狀況。采樣儀器為武漢市某公司生產(chǎn)的智能大容量懸浮微粒采樣儀(TH-1000型，流量為 1.05 m3/min)，用英國 Whatman 203 mm×254 mm石英纖維濾膜。樣品采集于2014 年1月8—25日(冬季)、4月7—27日(春季)、7月2—26日(夏季)和10月15 日至11月11日(秋季)，采集樣品個數(shù)分別為13、10、14、16個，總共53個樣品。每期進行連續(xù)采樣(除雨、雪天氣之外)，單次樣品采集時間為當(dāng)天10:00至翌日08:00，連續(xù)采集22 h，同時記錄氣象參數(shù)。

采樣前將石英纖維濾膜(英國)用鋁箔紙包好置于馬弗爐中，經(jīng) 450 ℃高溫灼燒5 h，除去膜上的有機物等污染物。采樣前后的濾膜均恒溫恒濕 [溫度(20±2) ℃，相對濕度45%～55%)]48 h，以減少水蒸氣的干擾。再進行稱重，2次平行稱重誤差不超過0.01 mg時取平均值，采樣前后膜的質(zhì)量差即為所采集顆粒物的質(zhì)量，根據(jù)采樣體積計算出PM2.5的質(zhì)量濃度。采樣后用鋁箔紙將膜包好裝入密封袋置于冷凍柜(-18 ℃)中保存。

1.2 MDA測定實驗

1.2.1 測定原理及標(biāo)樣的配制

測定MDA的實驗原理：MDA與TBA(2-硫代巴比妥酸，規(guī)格25 g，上海)在酸性條件下發(fā)生反應(yīng)，生成MDA-TBA紅色復(fù)合物，MDA-TBA復(fù)合物在535 nm處有最大吸收峰，可通過比色法進行檢測[15-17]。

實驗用混合顯色液的配制：準(zhǔn)確稱取TBA 2 g，用超純水溶解并于棕色容量瓶定容至1 000 mL，配制0.2%的溶液；準(zhǔn)確稱取TCA(三氯乙酸，規(guī)格500 g，天津)200 g，用超純水溶解并定容至1 000 mL棕色容量瓶中，配制20%的TCA溶液；再將2種溶液按體積比1∶1混合于棕色容量瓶中，備用[18]。

MDA標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：實驗用TEP(丙二醛二甲縮醛，規(guī)格100 g，北京)作為標(biāo)樣，采用逐級稀釋的方法配制0.25 μg/mL的TEP標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

樣品的制備：剪取一定量載有PM2.5顆粒的石英纖維濾膜稱重、剪碎，置入超純水中，用超聲波清洗器(KQ-250B，昆山)超聲一定時間洗脫顆粒物，待用。

1.2.2 檢出限及回收率

分別移取45 mL混合顯色液于5支50 mL的具塞比色管中，再分別準(zhǔn)確移取TEP標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液3、3.5、4、4.5、5 mL加入上述比色管中，用超純水定容至50 mL刻度線，用90 ℃恒溫水浴鍋加熱40 min，冷卻至室溫，在532 nm下測定其吸光值(可見光分光光度計，T6，北京)。在15～25 μg/L范圍內(nèi)，TEP的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=8.561C+0.037(r=0.999，式中A為吸光度，C為TEP質(zhì)量濃度，μg/L)。在此范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率為89%～100%。

1.3 質(zhì)粒 DNA 損傷評價實驗

DNA評價法是一種定量測量PM2.5中活性氧對質(zhì)粒DNA的氧化性損傷能力的體外方法，基本原理是顆粒物表面攜帶的自由基對超螺旋DNA產(chǎn)生氧化性損傷，最初的損傷引起超螺旋DNA松弛，進一步的損傷使DN線化。這種損傷變化引起 DNA在電泳儀中電泳淌度的變化，利用這一原理可以將不同形態(tài)的DNA在瓊脂糖凝膠中分離開來，然后使用靈敏的顯像測密術(shù)測量線狀的和松弛狀DNA在所有DNA中占的比例，可得出顆粒物對質(zhì)粒DNA氧化的程度[19-20]。實驗過程在中國礦業(yè)大學(xué)煤炭資源與安全開采國家重點實驗室(環(huán)境與健康實驗室)完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品加熱和超聲先后順序的確定

李娟等[21]研究了PM2.5對BEAS-2B細胞脂質(zhì)過氧化損傷作用，發(fā)現(xiàn)加熱和超聲順序會影響MDA的萃取率。因此，實驗中分別稱取約為0.1 g的膜，剪碎至25 mL混合顯色劑中并搖勻。做兩組實驗，每一組3個樣品。將其中一組具塞比色管放在超聲波清洗器中超聲40 min，再于90 ℃電熱恒溫水浴鍋中加熱40 min，取出后冷卻靜置12 h；另一組具塞比色管先放在90 ℃電熱恒溫水浴鍋中加熱40 min，再放在超聲波清洗儀中超聲40 min，取出后冷卻靜置12 h。分別取2組比色管的上清液10 mL于比色皿中，在波長532 nm下測其吸光度，求平均值，其結(jié)果見表1。由表1看出，先超聲后加熱所測樣品的吸光度為0.160，大于先加熱后超聲所測樣品的吸光度0.136，故選擇先超聲后加熱作為最佳實驗條件。

表1 超聲和加熱順序?qū)ξ舛鹊挠绊慣able 1 The influence on absorbance of ultrasonic and heating order

2.1.2 加熱時間和超聲時間的影響

有研究報道[22]，加熱時間和超聲時間影響樣品中MDA提取效果。為了確定加熱和超聲時間，準(zhǔn)確稱取采樣膜0.05 g左右，分別加入25 mL混合顯色液，混勻。將5支具塞比色管放在超聲波清洗器中超聲，超聲時間分別為20、30、40、50、60 min，在90 ℃電熱恒溫水浴鍋中加熱40 min，取出后冷卻靜置12 h。分別取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波長532 nm下測其吸光度，一個膜樣測3次求平均值，測定結(jié)果見圖1。超聲時間不同所測樣品的吸光度也不同，在超聲時間為40 min時出現(xiàn)最高吸收峰。因此，本實驗的超聲時間最終選擇40 min。

準(zhǔn)確稱取PM2.5采樣膜，剪碎后放入具塞比色管中，分別加入25 mL混合顯色液，混勻。將5支具塞比色管放在超聲波清洗器中超聲40 min，然后在90 ℃電熱恒溫水浴鍋中加熱，加熱時間分別為30、35、40、45、50 min。取出后冷卻靜置12 h，分別取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波長532 nm下測定其吸光度，每個樣品多次測定后取平均值。根據(jù)加熱時間和所對應(yīng)測定的吸光度繪圖。從圖1可知，加熱時間為40 min時出現(xiàn)最大吸收峰。因此，取加熱時間為40 min。

2.1.3 加熱溫度的影響

準(zhǔn)確稱取PM2.5采樣膜5份(每份約0.05 g)，剪碎，分別再加入25 mL混合顯色液，混勻。將5支具塞比色管放在超聲波清洗器中超聲40 min，分別在60、70、80、90、98.5 ℃條件下于恒溫水浴鍋中加熱40 min。冷卻靜置12 h，分別取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波長532 nm條件下測其吸光度，一個膜樣測3次，求平均值。從圖2可知，樣品的吸光度隨著溫度的上升而增大。但當(dāng)水浴加熱到90 ℃以上時，溶液中水的蒸發(fā)較為明顯，溶質(zhì)得到濃縮而使得溶液的吸光度劇增。為保證加熱過程溶液的濃度基本保持不變且能得到較高的吸光度，確定加熱溫度為90 ℃。

圖1 加熱時間和超聲時間對吸光度的影響Fig.1 The influence on absorbance of ultrasonic and heating time

2.1.4 顯色劑用量對吸光度的影響

準(zhǔn)確稱取PM2.5采樣膜5份(每份的質(zhì)量約0.05 g)剪碎，于25 mL具塞比色管中分別加入15、25、35、45、50 mL混合顯色液，混勻。超聲40 min，在90 ℃加熱40 min，冷卻靜置12 h，分別取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波長532 nm下測其吸光度，一個膜樣測3次求平均值。由圖2可以看出，顯色劑用量在45 mL時出現(xiàn)最大吸收峰，之后趨于平穩(wěn)。因此，確定顯色劑的用量為45 mL。

圖2 顯色劑用量及加熱溫度的影響Fig.2 The influence on absorbance of chromogenic agent and heating temperature

2.2 和田市城區(qū)PM2.5中MDA濃度的季節(jié)性分布

在最佳測定條件下(超聲40 min，在90 ℃水浴加熱40 min，顯色劑用量為45 mL，PM2.5樣品膜質(zhì)量為0.1 g)，采用三氯乙酸提取法測定了和田市城區(qū)總計53個PM2.5樣品中的MDA含量，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，4個季節(jié)PM2.5質(zhì)量濃度由高到低的順序依次為春季[602.12～1 591.70 μg/m3，平均值(1 096.67±369.60)μg/m3]、夏季[126.19～2 488.75 μg/m3，平均值(1 016.16±708.00) μg/m3]、秋季[231.48～1 771.48 μg/m3，平均值(686.88±525.0) μg/m3]、冬季[133.99～285.25 μg/m3，平均值(214.54±94.70)μg/m3]；MDA質(zhì)量濃度夏季最高[1.52～7.75 ng/m3，平均值(4.43±1.90) ng/m3]，秋季[1.32～5.35 ng/m3，平均值(2.83±1.30) ng/m3]和冬季[2.12～4.02 ng/m3，平均值(2.82±0.80) ng/m3]相近，春季最低[1.09～1.93 ng/m3，平均值(1.43±0.20) ng/m3]，PM2.5和MDA質(zhì)量濃度的變化趨勢不盡相同。經(jīng)分析，采樣期間和田市城區(qū)夏季平均溫度26.4 ℃，處于四季中的最高溫度，有利于PM2.5中有機物在大氣中進一步氧化和分解發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。而春季雖然PM2.5的質(zhì)量濃度最高，但是春季和田市大氣平均濕度最低(10.7%)，平均風(fēng)速最高(7.3 km/h)，均不利于大氣污染物的化學(xué)轉(zhuǎn)化過程。

2.3 MDA的體外氧化損傷能力

MDA具有一定的致癌作用[4]，因此將所測得的PM2.5的水樣和全樣的TD30(造成DNA30%損傷所需劑量)與相應(yīng)樣品中MDA的質(zhì)量濃度進行了線性回歸分析，結(jié)果如圖4所示(n=19)。由圖4可以看出，無論是全樣還是水樣的TD30均隨MDA濃度的增加而降低，而且全樣的TD30值與MDA呈顯著負相關(guān)(r=-0.597，顯著性P<0.01)。表明PM2.5中的MDA具有一定的氧化損傷，而全樣的氧化損傷更為顯著。因MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，又是細胞受損傷的標(biāo)志，其本身又會對細胞造成一定傷害[23-24]。所以，隨著MDA質(zhì)量濃度的升高，造成DNA30%損傷所需要的劑量呈下降趨勢。

圖4 丙二醛對體外DNA氧化性損傷的影響Fig.4 The effects of MDA to DNA oxidation damage

3 結(jié)論

1)PM2.5膜中MDA含量測定的最佳實驗條件：先超聲40 min，然后再90 ℃水浴加熱40 min，用膜量約為0.1 g，顯色劑的最佳用量為45 mL。

2)和田市城區(qū)4個季節(jié)PM2.5質(zhì)量濃度由高到低的順序為春季、夏季、秋季、冬季，MDA濃度的平均值最高為夏季，最低為春季，冬季與秋季相近。

3)和田市城區(qū)PM2.5中MDA質(zhì)量濃度與PM2.5水樣的TD30存在負相關(guān)趨勢，而全樣則存在顯著負相關(guān)。說明PM2.5中的MDA對人體具有氧化損傷的作用。