自噬介導的雷公藤甲素提高西妥昔單抗對SW480細胞治療效果的實驗研究

白利平，康向鵬，林 立，林偉箭，丁志杰

(廈門大學附屬中山醫院胃腸外科，廈門大學胃腸腫瘤研究所，福建 廈門 361004)

近年來，隨著對腫瘤細胞信號轉導通路研究的不斷深入，以及高通量基因測序技術的進步，腫瘤藥物的治療越來越集中于針對腫瘤細胞受體、細胞周期、細胞信號轉導、腫瘤血管等方向的分子靶向治療。在結直腸癌，特別在轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer,mCRC)治療方面，以表皮生長受體為靶點的西妥昔單抗(cetuximab，CET)取得了較好的臨床療效。然而，隨著CET的臨床應用，其耐藥問題日益突出，特別是其影響的信號轉導通路中K-Ras、B-Raf基因的突變，以及上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)都成為導致其耐藥的主要原因[1-2]。雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱雷公藤內酯醇，是雷公藤多苷的主要有效成分。早期研究表明，TP在抗炎和免疫抑制方面有較多應用。近年來在抗腫瘤方面的研究發現，TP能有效抑制腫瘤細胞的生長和轉移[3]。多項研究表明，TP能誘導多種腫瘤發生自噬增強。自噬是細胞對衰老或凋亡細胞的自我消化以及維系細胞能量代謝的過程，對維持細胞內環境穩定及面臨微環境壓力時自我存活，均起關鍵作用[4]。

在腫瘤發生、發展過程中，自噬這一生理過程不僅可以表現為促癌，而且也可以表現為抑癌。近來研究表明[5-7]，同樣作為腫瘤發生、發展過程中重要的環節，自噬和EMT既有聯系又有區別：一方面，發生EMT的細胞需要自噬激活，獲取更多能量來維持其在轉移擴散期間的存活；另一方面，在腫瘤發生初期，自噬通過選擇性地破壞EMT過程的關鍵信號分子,從而抑制腫瘤的侵襲和轉移。因此，本研究旨在探討TP聯合CET對人結腸癌細胞SW480生長和轉移的影響，并分析其可能的作用機制，以期為結直腸癌的藥物預防和治療尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人結腸癌SW480細胞系，購自中國醫學科學院細胞庫，由廈門大學附屬中山醫院中心實驗室保存。DMEM高糖培養加入10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素和100 U·L-1鏈霉素,放置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養, 細胞生長為單層細胞，待細胞貼壁80%～90%，以0.25%含有EDTA的胰酶消化并傳代。

1.1.2藥物與試劑 CET(5 g·L-1, 德國默克制藥公司),用前以培養液稀釋,使終濃度為100 mg·L-1；TP(Sigma公司)，以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，稀釋成100 mmol·L-1,-20 ℃保存,用前以培養液梯度稀釋成終濃度。DMEM培養基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青)；p62、LC3、E-cadherin、Snail、β-actin抗體(Cell Signaling公司)；Twist2、Vimentin抗體(Abcam公司); BCA試劑盒(Thermo公司)。

1.1.3儀器 CO2培養箱(Thermo Fisher公司);倒置顯微鏡(Olympus公司)；多功能酶標儀、凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司);紫外分光光度計(Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1MTT檢測細胞增殖 0.25%胰酶消化SW480細胞,計數，并按照每孔4 000個細胞接種于96孔板中,過夜貼壁培養后，加入不同濃度的TP(5、10、20、50 nmol·L-1)和CET(25、50、100、200 mg·L-1)處理SW480細胞,對照組加入PBS,培養24、48、72 h。培養終點, 每孔加20 μL MTT(5g·L-1)，繼續37 ℃培養4 h，吸棄培養基,每孔加入150 μL DMSO,室溫振蕩10 min,490 nm波長下測定各孔吸光度值。

1.2.2細胞劃痕實驗 細胞計數，按1×105細胞數目接種于6孔板，使用無血清培養基過夜培養后，用200 μL移液槍槍頭在單層細胞上豎直劃痕，用PBS清洗3次，然后按實驗組和對照組加入TP單藥和聯合藥物，分別培養24、48 h，顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件統計分析。遷移率/%=(邊緣距離0 h-邊緣距離24 h/48 h)/邊緣距離0 h×100%。

1.2.3細胞克隆實驗 細胞培養后，胰酶消化并計數，接種于6孔板中，過夜培養后，分為TP組、CET組和TP聯合CET組，培養48 h后，再次消化細胞，按密度500個/孔接種于6孔板中，連續培養2周，確定集落形成后，將培養物3.7%多聚甲醛和70%乙醇固定，并用0.05%考馬斯藍染色。顯微鏡下計算細胞克隆數(>50個細胞的集落數)?？寺⌒纬陕?%=克隆數/接種細胞數×100%。

1.2.4Western blot實驗 待細胞進入對數生長期，用0.25%含有EDTA胰酶消化，離心后細胞重懸，計數，接種于6 cm2培養皿，12 h貼壁后，加入不同濃度TP(10、20、50 nmol·L-1)處理SW480細胞，按實驗設計，設置不同的終止時間點。提取蛋白前去處細胞培養液，預冷PBS清洗3次，冰上細胞刮快速刮下細胞，并轉移至1.5 mL EP管,使用預冷的RIPA蛋白裂解液，加前注意按比例加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解15～20 min,然后4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min,將上清蛋白吸至新的1.5 mL EP管中。BCA試劑盒測定蛋白濃度,并計算所加蛋白量，加入上樣緩沖液，98 ℃煮沸10 min，低溫保存。SDS-PAGE電泳，分離蛋白,將蛋白轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉孵育2 h封閉,加入稀釋的一抗p62、LC3-Ⅱ、mTOR、Snail、Twist2抗體和β-actin抗體(內參),4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,加入稀釋的相應二抗,室溫孵育1 h;TBST洗膜3次,采用Image-Pro Plus軟件進行灰度值分析,以各目的條帶與內參條帶的平均灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1TP及TP聯合CET對SW480細胞增殖的抑制作用MTT法檢測結果顯示,TP和CET均可抑制SW480細胞的生長,與空白對照組比較，TP呈明顯的劑量依賴性和時間依賴性，而且在5～20 nmol·L-1顯示更好的劑量依賴，抑制率明顯下降，20～50 nmol·L-1顯示更好的時間依賴性；而CET僅顯示劑量依賴性。由于TP(50 nmol·L-1)72 h抑制率近80%( Fig 1A)，大量細胞死亡，而CET大于100 mg·L-1抑制效率下降(Fig 1B)，因此，本研究選擇TP(20 nmol·L-1)和CET(100 mg·L-1)為后續實驗的濃度。進一步實驗證明，與TP(20 nmol·L-1)和CET(100 mg·L-1)單藥組相比, TP和CET聯合處理組細胞的增殖率均明顯下降(P<0.05，Fig 1C)。克隆形成實驗結果顯示，CET聯合TP處理組的細胞集落數量和大小形態均小于CET單藥處理組。兩藥聯合組的克隆形成率明顯下降(P<0.05),兩藥聯合對于SW480細胞的克隆形成有明顯交互抑制作用(Fig 1D)。

2.2TP誘導SW480細胞自噬Western blot檢測結果表明, TP(0、10、20、50 nmol·L-1)作用SW480細胞24 h,隨著TP濃度的增加，自噬標志蛋白LC3-Ⅱ表達水平也逐漸升高,而p62表達隨TP濃度增加卻逐漸下降，表現出明顯的濃度依賴性(Fig 2A)。用20 nmol·L-1TP作用SW480細胞0、12、24、48 h發現,LC3-Ⅱ蛋白的相對表達水平隨著作用時間的延長不斷升高,p62表達則相反，均呈時間依賴性(Fig 2B)。數據顯示經TP處理后，LC3-Ⅱ蛋白的表達升高, p62蛋白表達下降，表明TP誘導SW480細胞自噬加強。

2.3TP及TP聯合CET對SW480細胞期遷移的影響劃痕實驗結果顯示，與對照組比較，CET(100 mg·L-1)組細胞的遷移率無明顯減小(P>0.05)，而TP(20 nmol·L-1)組則明顯減小(P<0.01);與單藥組(CET)比較，TP(20 nmol·L-1)+CET(100 mg·L-1)聯合治療組細胞的體外遷移距離明顯減小(P<0.01，Fig 3A、3B)。說明TP不僅能明顯抑制結腸癌SW480細胞的體外遷移能力，而且與CET聯合應用具有明顯協同作用。進一步的Western blot檢測結果顯示，相對于CET單藥組，上皮相關標志物E-cadherin在TP單藥以及TP+CET聯合處理組表達均上調，而間質相關標志物Vimentin表達相應下調(Fig 3C、3D)。提示TP通過上調E-cadherin和下調Vimentin的表達，逆轉CET介導的EMT。

Fig 1 The effect of triptolide in combination with cetuximab on cell viability, clonogenicity in SW480 n=3)

The cell viability of human colorectal cancer SW480 cells treated with TP(0, 5, 10, 20, 50 nmol·L-1)(A) or CET(0, 25 50, 100, 200 mg·L-1) alone(B) for 24, 48, 72 h and TP(20 nmol·L-1) or CET(100 mg·L-1) alone or both together for 48 h(C) were detected by MTT assay; D: colony formation was performed with SW480(800 cells/well, 2 weeks).*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsCET

2.4TP通過mTOR信號通路誘導自噬，抑制SW480細胞的EMTFig 4的Western blot結果顯示，TP(20 nmol·L-1)分別作用于SW480細胞0、12、24、48 h，不僅抑制了自噬相關蛋白p62的表達，同時明顯抑制了mTOR的磷酸化，而總mTOR未發生明顯改變，說明TP是通過mTOR通路誘導細胞自噬。進一步研究發現，EMT上游信號通路中Snail、Twist蛋白也隨著TP處理的時間延長而表達下調，說明TP能通過mTOR信號通路誘導結腸癌SW480細胞發生自噬，而且由自噬介導通過Snail、Twist通路改變E-cadherin和Vimentin表達，抑制EMT。

3 討論

TP具有解毒散結、活血化瘀、扶正祛邪等多種功效,近來研究表明，其對多種腫瘤具有良好的抗腫瘤活性。在本研究中，我們嘗試用TP與血管靶向藥物CET做平行對照研究，采用MTT法觀察其對SW480細胞增殖的影響。結果顯示，由低到高不同濃度TP(5～50 nmol·L-1)對SW480細胞體外增殖的抑制作用(0～72 h)，顯示出明顯劑量和時間依賴性,48 h內IC50值在20 nmol·L-1，而CET也具有抑制細胞增殖的作用，但相對于TP抑制率不高，也無明顯時間依賴性；進一步將兩藥聯合作用發現，TP聯合CET組抑制細胞增殖明顯強于單藥組，說明兩藥在抗腫瘤方面具有協同作用。在細胞克隆形成實驗中，與對照組相比，兩藥聯合組細胞克隆形成的數目明顯低于單藥組，差異具有統計學意義。

Fig 2 Triptolide could induce autophagy and affect the expression of autophagy-related

A: Triptolide could affect the expression of p62 and LC3 caused a dose-dependent following 24 h triptolide treatment; B: Triptolide could affect the expression of p62 and LC3-Ⅱ caused a time-dependent following triptolide(20 nmol·L-1) treatment.*P<0.05vscontrol

Fig 3 The effect of triptolide in combination with cetuximab on EMT and metastasis in

A: The effect of triptolide, cetuximab alone or both together on the migration in SW480 cell was detected by wound healing assay; B:Images obtained from above were analyzed the percentage of the wounded area covered by the cells from the different treatment groups; C: Expressions of E-cadiherin and Vimentin was detected by Western blot. SW480 cells were treated with 20 nmol·L-1TP, 100 mg·L-1CET.*P<0.05,**P<0.01vscontrol，#P<0.05,##P<0.01vsCET

Fig 4 The effect of triptolide on

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

自噬具有雙面性，對腫瘤來講，有時有利于維持腫瘤存活，它可以回收營養物質和衰老的細胞器，使得能量得以重新回收和利用，但同時它也抑制腫瘤細胞的生長，激活凋亡信號通路，導致細胞發生自噬性細胞死亡(autophagic cell death,ACD)[8-9]。LC3和SQSTM1/p62是自噬中的標記蛋白質。本實驗結果顯示經TP處理后，無論是隨作用時間延長，還是藥物濃度增加，均表現為LC3-II/I比值升高，說明胞質型LC3(即LC3-Ⅰ)酶解后,轉變為(自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ),促進自噬小體的形成，自噬增強；同時檢測到SQSTM1編碼的泛素結合蛋白p62發生明顯一致性下調，說明作為自噬的選擇性底物，p62發生大量的聚集，最終進入到成熟的自噬體內，并在自噬體內降解，更進一步說明TP不僅抑制細胞活性及增殖，同時TP誘導上調LC3-Ⅱ蛋白的表達,下調p62蛋白的表達，從而誘導自噬性凋亡。趙林等[10]研究也發現，在TP聯合自噬抑制劑3-MA處理HCT116細胞后，細胞凋亡率明顯下降，而聯合自噬誘導劑RAPA,細胞凋亡率明顯上升，說明自噬的發生誘導細胞發生凋亡，也就說明引起了自噬性死亡，這種死亡是獨立于caspase信號通路之外引起的細胞死亡。

EMT的發生關鍵標志是E-cadherin表達下降，EMT因子Twist1、Twist2、Snail、Slug、ZEB1和SIP1等都能與E-cadherin啟動子的E-box結合,抑制E-cadherin的轉錄。CET等靶向藥物主要可以抑制腫瘤組織的血管生成，進而使腫瘤組織缺氧，而在缺氧狀態下，腫瘤細胞更容易發生EMT，從而遷移性和侵襲性增強。因此，EMT不僅是腫瘤耐藥的重要機制，也成為靶向藥物耐藥的標志。逆轉EMT或殺死EMT腫瘤細胞成為潛在的腫瘤治療策略。劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，CET對細胞遷移能力沒有明顯影響，而TP不僅表現出抑制細胞發生遷移作用，而且聯合CET組明顯提高了單獨CET組的抑制率，說明TP可能具有逆轉CET的EMT作用。進一步免疫印跡實驗結果顯示，TP組可以上調E-cadherin蛋白表達，同時下調Vimentin蛋白，在分子水平上印證其具有抑制EMT作用。進一步實驗結果顯示，TP刺激細胞后，引起Twist、Snail的表達下調，因而證明，TP引起的E-cadherin過表達是由其上游Twist、Snail因子下調后，減少對E-cadherin的抑制作用，從而減少EMT的發生。雖然EMT需要潛在轉移細胞以自噬的方式維持細胞的能量和代謝，但仍有證據表明，自噬的激活和增強可以逆轉EMT細胞轉移表型，從而抑制EMT的發生[11-12]。研究發現，在膠質瘤細胞中，通過應激或營養缺乏誘導細胞自噬增強，通過經典的mTOR途徑抑制EMT,導致細胞遷移減少，侵襲力減弱[13]。本研究發現，TP作用于SW480細胞，通過mTOR通路誘導自噬，下調p62蛋白，同時相應下調Snail、Twist的表達，預示p62的下調可能與發生EMT的分子機制相關。Grassi等[14]發現，誘導自噬增強能降低p62，使得Snail發生高降解，表達水平下降，EMT的抑制增強；EMT相關蛋白Snail、Twist等的降解與p62參與的選擇性自噬有關[15-16]。本實驗印證了自噬標記蛋白p62與發生EMT關鍵分子呈正相關，至于TP是直接磷酸化Akt/mTOR通路，還是經過其上游分子或旁路分子的表達，從而進一步激活mTOR,以及p62與Snail、Twist是直接作用，還是間接作用，仍需要后續進一步驗證。

綜上所述，本研究發現TP抑制腫瘤細胞SW480的增殖，誘導其發生自噬性凋亡，并且可以抑制其EMT，同時聯合CET具有明顯協同的作用，證實了TP通過mTOR通路誘導腫瘤細胞自噬增強，在自噬與EMT的交叉對話中，發現p62可能作為調節兩者通路一個關鍵因子。這些可以作為線索，為后續研究腫瘤細胞自噬和侵襲、轉移的關系提供可能和依據。