地塞米松降低紫杉醇對肺癌細胞化療作用的實驗研究

高雅茹，王 瑋，袁 夏，賈婷婷，張 蝶，袁 易，曾海榮

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院藥學部，上海 200062)

隨著社會的發展，環境污染的日益嚴峻，以及人類生活方式的改變，癌癥已經成為威脅人類生命健康頭號殺手。2018年，美國癌癥協會統計表明，無論是新發率還是死亡率，男女排名前三的癌癥分別是前列腺癌、肺癌、結直腸癌和乳腺癌、肺癌、結直腸癌[1]，無論男女，肺癌的新發率和死亡率都占據前二位。但是，現在臨床上還沒有一個方法或者藥物能夠治愈肺癌，目前臨床上主要的措施是采取手術切除和放化療的方法[2-3]。近來選擇靶向治療的患者越來越多，然而靶向治療的費用昂貴，放化療還是主要的選擇，但是其最主要及最容易發生的一個副作用就是惡心、嘔吐及過敏反應[4-5]，所以很多的臨床醫生會選擇在化療前給予患者托烷司瓊、地塞米松(dexamethasone，Dex)等藥物，以減輕放化療的副作用發生[6]。很多研究都報道，Dex和紫杉醇會相互拮抗，誘導耐藥性的產生，降低化療效果[7-8]。本文將運用體外、體內相結合的方法，考察Dex聯合紫杉醇對肺癌細胞A549、Calu-1的作用，尋求相互作用的可能機制，為臨床用藥提供參考。

1 材料

1.1細胞株與實驗動物肺癌細胞A549、Calu-1，購自中科院細胞庫。BALB/c-nu ♂裸鼠18只，體質量(20±2) g，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供，SCXK(滬)2017-0005。

1.2藥物與試劑紫杉醇、MTT，購自Sigma公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、Matrigel基質膠，購自Gibco公司；糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GR)、P-糖蛋白(p-glycoprotein, P-gP)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1, MRP-1)抗體，均購自CST公司。

1.3儀器CO2細胞培養箱、高速低溫離心機、多功能酶標儀(美國Thermo公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；游標卡尺(桂林廣陸數字測控股份有限公司)；流式細胞儀(BD公司)。

2 方法

2.1細胞活力的測定A549、Calu-1細胞培養于DMEM高糖培養基中(含10%胎牛血清、1%雙抗)。細胞培養于直徑為10 mm培養皿中，5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，細胞長至80%～90%匯合后進行實驗。細胞消化后，以1×104個/孔細胞接種于48孔板中，待細胞過夜貼壁后，分別以紫杉醇(0、0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1)及Dex(10 μmol·L-1)聯合紫杉醇(0、0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1)作用于細胞48 h，空白對照組僅含有培養基，細胞對照組僅含有細胞及培養基。然后加MTT(終濃度為0.5 g·L-1)作用4 h，棄上清，每孔加入400 μL的DMSO溶解結晶，然后酶標儀570 nm測吸光度(OD)。按照如下公式計算細胞存活率，細胞存活率%=(加藥處理組OD均值-空白對照組OD均值)/(細胞對照組OD均值-空白對照組OD值)×100%。利用Graphpad Prism軟件計算出藥物的半數致死濃度(IC50)值。

2.2細胞周期的測定由細胞活力結果知，Calu-1較A549受Dex的影響較明顯，所以在后續的實驗中選擇Calu-1。將Calu-1細胞以2×108·L-1接種于6孔板中，每孔2 mL細胞懸液，于培養箱貼壁過夜后，實驗分對照組、紫杉醇(2.5 μmol·L-1)組、紫杉醇(2.5 μmol·L-1)與Dex(10 μmol·L-1)聯用組，每組2孔，藥物處理48 h，收集每組細胞，加入1 mL預冷70%乙醇吹打均勻，4 ℃固定2 h，離心棄上清，每個EP管加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 °C避光孵育0.5 h,于流式細胞儀在激發波長488 nm處檢測紅色熒光，采用流式軟件進行細胞細胞DNA含量分析。

2.3Westernblot檢測GR、P-gP、MRP-1蛋白的表達將Calu-1 2×108·L-1接種于6孔板中，每孔2 mL細胞懸液，于培養箱貼壁過夜后，實驗分組同“2.2”，藥物處理48 h，除去培養基，加入2 mL PBS洗1遍，吸干PBS，加入蛋白裂解液60 μL，于冰上裂解10 min，刮刀收集蛋白裂解液，并于冰浴超聲離心1次，BCA測蛋白濃度，按體積4 ∶1加入5×loading buffer，于恒溫金屬浴100 ℃變性5 min，保存于-20 ℃冰箱。采用10% SDS-PAGE電泳，轉膜，NC膜用5%的脫脂奶粉室溫封閉 1 h，TBST緩沖液快速洗膜3次，每次8 min，然后一抗4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液快速洗膜3次，每次8 min，HRP偶聯的相應二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液快速洗膜3次，每次8 min，ECL顯影液顯影。

2.4裸鼠移植瘤模型的建立取對數生長期的Calu-1細胞，用無血清DMEM培養基及Matrigel基質膠等體積混合液校準細胞濃度，在裸鼠右側腹部皮下注射100 μL的Calu-1細胞懸液，含有1×106個細胞，實驗流程圖按照Fig 4A進行。定期觀察小鼠的行為及腫瘤的形成、生長，游標卡尺測量其最長徑和最短徑，計算瘤體積(V)，V=(ab2)/2，a為長徑，b為短徑。

2.5實驗分組及給藥待裸鼠的瘤長徑長至3～5 mm后，按照瘤體積大小，將裸鼠隨機分為3組：對照組(生理鹽水0.2 mL)、紫杉醇組(2 mg·kg-1)、聯合用藥組(紫杉醇2 mg·kg-1+Dex 5 mg·kg-1)，每周給藥3次，每周測量小鼠體質重及腫瘤的大小，d 25處死動物，收集腫瘤組織。

3 結果

3.1Dex降低紫杉醇對肺癌細胞A549、Calu-1的敏感性如Fig 1所示，與紫杉醇單獨作用相比，紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于細胞48 h，明顯降低了紫杉醇對細胞的敏感性，使IC50明顯提高(A549細胞：IC50由0.58 μmol·L-1提高到1.35 μmol·L-1；Calu-1細胞：IC50由1.10 μmol·L-1提高到2.10 μmol·L-1)。

Fig 1 Dex reduced susceptibility of paclitaxel to lung cancer cells A549(A) and Calu-1(B) n=3)

**P<0.01 Paclitaxel+DexvsPaclitaxel

3.2紫杉醇和Dex聯用對細胞周期的影響如Fig 2所示，紫杉醇單獨作用于Calu-1細胞48 h，使細胞明顯阻滯于G1期，當紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于細胞48 h時，則阻滯效果要弱于紫杉醇單獨作用。可見Dex和紫杉醇共同作用時會減弱紫杉醇的作用，可能與耐藥性的產生有關。

3.3紫杉醇和Dex聯用對多藥耐藥蛋白的影響如Fig 3 所示，當紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于細胞48 h時，GR表達明顯增多。紫杉醇和Dex(10 μmol·L-1)作用于細胞48 h時，P-gP、MRP-1蛋白的表達明顯高于其他組，很可能是Dex-GR信號激活，進而使P-gP、MRP-1蛋白表達升高，從而產生耐藥性。

3.4紫杉醇和Dex聯用對體內裸鼠移植瘤的影響如Fig 4所示，紫杉醇單獨作用時可以明顯減小腫瘤的體積、腫瘤的重量，顯示明顯的抗腫瘤作用。但是紫杉醇和Dex聯用時，與紫杉醇單獨作用相比，腫瘤的體積和重量明顯增大，說明紫杉醇和Dex聯用可能降低了紫杉醇的抗腫瘤作用，這可能與產生耐藥性有關。

Fig 2 Effects of paclitaxel combined with Dex on cell cycle n=3)

Fig 3 Effects of paclitaxel combined with Dex on multidrug resistance protein expression n=3)

Fig 4 Effects of paclitaxel combined with Dex on transplanted tumor in nude mice n=6)

A: Flow chart of therapy scheme; B: The body wight changes with treatment; C: Tumor volume changes with treatment; D: The tumor weight of each group; E: The tumor figures of each group.#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vspaclitaxel

4 討論

紫杉醇是目前臨床上肺癌、乳腺癌等癌癥化療選擇的一線藥物，它最主要的功能是影響細胞有絲分裂過程中微管的形成，從而引起細胞的死亡，廣泛用于乳腺癌、肺癌患者的化療中。在化療過程中，紫杉醇產生的副作用及耐藥性也得到越來越多的重視[9]。惡心、嘔吐及過敏反應是其主要的副作用，臨床上往往會在化療的時候給予Dex來減少副作用。本研究主要從體內、體外實驗，研究使用Dex聯合其他化療藥物(如紫杉醇)對化療效果的影響。

糖皮質激素(如Dex)在臨床上常用于減輕腫瘤患者在放化療過程中產生的惡心、嘔吐及過敏反應，改善食欲，減輕骨痛，抑制水腫[10-12]。但是，最近的研究發現，糖皮質激素可能會導致很多的化療藥物在多種實體瘤中發生化療抵抗，糖皮質激素抑制肝癌、食道癌、結直腸癌、膀胱癌細胞的凋亡[13]。在本研究中，我們也證實了Dex可能會導致紫杉醇對肺癌細胞發生抵抗，但是具體的作用機制不清楚。

糖皮質激素是由腎上腺皮質分泌的類固醇激素，包括皮質醇和皮質酮，GR是典型的激素依賴型受體，是核受體的重要成員，當Dex作用于細胞時，會與GR結合。有研究表明，Dex會上調Krüppel樣因子5(Krüppel-like factor 5, KLF5)的表達，而促進化療耐藥[14]。Dex-GR信號軸對化療耐藥起到關鍵作用，有研究表明，阻斷Dex-GR信號能夠減輕化療抵抗[15]。P-gP、MRP-1是耐藥性產生的兩個關鍵蛋白，本研究也觀察到Dex能使P-gP、MRP-1表達增多，進而產生耐藥性，這在體內實驗也得到相似的結果。提示Dex-GR信號軸激活使P-gP、MRP-1表達增多致使耐藥性的產生可能為其機制之一。

綜上，體內、體外實驗都觀察到Dex聯合紫杉醇使肺癌細胞敏感性降低，產生耐藥，使紫杉醇的化療效果較低。因此，在臨床上選擇紫杉醇作為化療藥物時，應慎重選擇Dex，或者考慮其他藥物來減輕副作用。