補骨脂異黃酮對炎癥小體的調控作用及機制初探

秦 楠，徐 廣，高 源,3，王智磊,4，付書彬，劉慧敏，肖小河，趙海平，柏兆方

(1. 江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004; 2．中國人民解放軍總醫院第五醫學中心中藥研究所，北京 100039; 3. 北京中醫藥大學藥學院，北京 100029；4. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137)

炎癥小體是存在于胞質內，參與免疫應答的一類多聚蛋白復合物，可調控機體清除病原體和損傷細胞,在先天免疫應答中發揮重要作用。炎癥小體由炎癥小體感受器(如NLRs)、接頭蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)、半胱天冬蛋白酶的前體(pro-caspase-1)組成，且介導細胞焦亡和IL-1β、IL-18等細胞因子的分泌[1]。研究發現，多種疾病的發生與NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor 3, NLRP3)、NOD樣受體家族半胱天冬酶激活募集結構域4(NOD-like receptor containing a caspase activating and recruitment domain 4，NLRC4)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)炎癥小體的過度激活密切相關[2]。其中，NLRP3炎癥小體能被ATP、Nigericin等多種內源性或外源性因素激活[3]；AIM2炎癥小體通過感應病原微生物或者宿主細胞的雙鏈DNA(ds DNA)募集ASC產生，誘導炎癥小體組裝[4]；而NLRC4炎癥小體則被沙門菌、嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌等細菌中的鞭毛蛋白激活[5]。三種炎癥小體都可導致IL-1β、IL-18等促炎因子活化和分泌，激活過度則導致疾病的發生。

補骨脂為豆科植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實，具有補腎壯陽、溫脾止瀉、納氣平喘的功效[6]，相關制劑主要用于治療關節炎、骨質疏松等疾病[7]。研究發現，類風濕性關節炎與NLRP3炎癥小體的異常激活密切相關。類風濕性關節炎屬于常見的一類自身免疫性疾病，但隨著機體免疫系統的紊亂，滑膜組織中的固有免疫細胞和適應性免疫細胞及分泌的炎性因子，使得炎癥持續存在，可引起關節軟骨和骨組織的破壞，最終導致關節畸形及功能喪失[8]。補骨脂的主要活性成分有香豆素、黃酮、單萜酚類化合物等，香豆素成分包括補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂定、8-甲氧基補骨脂素、8-羥基補骨脂素等，黃酮類成分包括補骨脂異黃酮(結構式見Fig 1)等[9]。補骨脂作為傳統骨科常用藥，可用于治療類風濕性關節炎，但補骨脂抗炎的具體成分及其作用機制尚不清楚。本文擬探討補骨脂成分是否能通過調控炎癥小體活性，減輕免疫炎癥反應，為炎癥小體相關疾病治療提供依據。

1 材料

1.1藥物補骨脂素(psoralen，批號：17110104)、異補骨脂素(angelicin，批號：18033005)、補骨脂異黃酮(corylin，批號：17092503)、補骨脂定(psoralidin，批號：16042601)、8-甲氧基補骨脂素(8-methoxypsoralen，批號：161019)、8-羥基補骨脂素(xanthotol，批號：160904)，均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度>98%。

Fig 1 Structure of corylin

1.2試劑DMEM培養基、胎牛血清(美國HyClone公司)；Opti-MEM無血清培養基(美國Gibco公司)；三磷酸腺苷 (ATP)、尼日利亞菌素 (Nigericin)、脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)、沙門氏菌(Salmonella)、 Poly(deoxyadenylic-deoxythymidylic), (Poly(dA:dT))、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma Aldrich公司)；NLRP3、ASC、caspase-1 p20、pro-caspase-1、 mature IL-1β、pro-IL-1β、Tubulin、GAPDH抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；CCK-8試劑盒(美國MedChemExpress公司，產品編號：HYK03013000T)；Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay測定試劑盒 (美國 Promega公司，產品編號：G9952)；TNF-α ELISA 檢測試劑盒(北京達科為生物技術有限公司，產品編號：122720)。

1.3儀器二氧化碳培養箱(美國Thermo Scientific公司)；酶標儀(美國Promega 公司)；低溫高速離心機(美國Sigma公司)；電泳槽、轉印槽、凝膠電泳分析系統(美國Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1細胞培養小鼠骨髓來源巨噬細胞系(immortal bone marrow-derived macrophages，iBMDM)、人正常肝細胞(L02)、人肝星形細胞(LX-2)，均購自中國科學院上海細胞所。培養于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基中，5% CO2、37 ℃恒溫培養，細胞生長至80%～90%豐度時,傳代或用于實驗。細胞接種于12孔、24孔或 96孔培養板中, 備用。

2.2CCK-8細胞毒性實驗取培養至80%～90%豐度的 iBMDM和L02細胞, 于96孔板中接種細胞懸液(每孔100 μL), 密度2.5×108·L-1。iBMDM 和L02細胞分為正常組、0.1% DMSO組、不同濃度的補骨脂異黃酮組(0.625、1.25、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 μmol·L-1),培養 24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，結合試劑盒說明書及預實驗結果，培養箱內培養15 min后, 450 nm處測定吸光度值。

2.3細胞刺激方式iBMDM細胞中評價炎癥小體活性：取培養至80%～90%豐度的 iBMDM細胞，于24孔板中接種細胞懸液(每孔500 μL),細胞密度為8.5×108·L-1，置于培養箱中預培養12～16 h,50 μg·L-1LPS預處理h后,加入含各單體化合物的opti-MEM無血清培養基處理1 h，而后ATP(5 mmol·L-1)、Nigericin(20 μmol·L-1)刺激1 h；沙門氏菌刺激4 h、轉染Poly(dA ∶dT)(2 mg·L-1)刺激6 h,按文獻方法，處理細胞上清和細胞裂解液[10]。

iBMDM、LX-2細胞中評價NF-κB活性：取培養至80%～90%豐度的iBMDM和LX-2細胞，于24孔板中接種細胞懸液(每孔500 μL),細胞密度為6.5×108·L-1,培養板置于培養箱中預培養12～16 h,加入含不同濃度的補骨脂異黃酮(6.25、12.5、25 μmol·L-1)處理1 h，而后加入50 μg·L-1LPS刺激4 h后,分別收取細胞上清和細胞裂解液。

2.4Westernblot檢測細胞NLRP3、ASC、caspase-1、pro-caspase-1，pro-IL-1β蛋白水平細胞上清蛋白樣品采用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳, 細胞裂解液樣品采用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜后,5%脫脂奶室溫封閉1 h, 不同一抗(1 ∶1 000)溶液4 ℃孵育過夜, 洗膜3次后, 孵育相應二抗( 1 ∶5 000) 1 h，洗膜3次后，顯影觀察條帶變化。

2.5ELISA法測定iBMDM細胞上清液中TNF-α含量收集iBMDM細胞培養上清液。室溫4 000 r·min-1離心5 min，取上清。ELISA 法測定上清TNF-α含量，操作步驟按說明書進行。

2.6Caspase-1活性測定按照Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay測定試劑盒說明書進行操作。先室溫平衡Caspase-Glo?1緩沖液、Z-WEHD熒光素底物及MG-132抑制劑，然后在10 mL Z-WEHD-氨基熒光素底物中，加入60 μL MG-132(120 μmol·L-1)抑制劑充分渦旋至徹底混合，再加入Caspase-Glo?1緩沖液，充分渦旋，形成終濃度為60 μmol·L-1的熒光檢測混合物，待用。96孔板中加入細胞上清樣本，每孔再加入已配制待用的熒光檢測混合物，細胞培養板振蕩器振蕩1 min,室溫避光平衡，使樣品與熒光底物充分結合，1 h后經酶標儀檢測分析caspase-1熒光值。

3 結果

3.1篩選鑒定補骨脂化學成分對NLRP3炎癥小體活性的影響通過文獻調研補骨脂化學成分，篩選6種補骨脂單體化合物：補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂定、8-甲氧基補骨脂素、8-羥基補骨脂素、補骨脂異黃酮，評價其在20 μmol·L-1濃度下對LPS聯合ATP誘導的NLRP3炎癥小體活性的作用。caspase-1活性檢測結果顯示，在細胞培養上清中，補骨脂異黃酮中caspase-1 產生明顯降低，表明補骨脂異黃酮可抑制ATP誘導的NLRP3炎癥小體活性(Fig 2)。

3.2補骨脂異黃酮對iBMDM和L02細胞的毒性作用利用 CCK-8實驗，檢測補骨脂異黃酮對iBMDM和L02細胞的毒性。與對照組相比，隨著補骨脂異黃酮給藥濃度增加，iBMDM和L02細胞存活率呈梯度降低。在iBMDM中，補骨脂異黃酮的半數抑制濃度(IC50)為108 μmol·L-1，最大無毒劑量是28 μmol·L-1；在L02細胞中，IC50為123 μmol·L-1，最大無毒劑量是23.8 μmol·L-1。本研究中使用的補骨脂異黃酮最高濃度為20 μmol·L-1，該濃度范圍內無細胞毒性(Fig 3)。

3.3補骨脂異黃酮濃度依賴性抑制ATP和Nigericin誘導的NLRP3炎癥小體活性為進一步明確補骨脂異黃酮對NLRP3炎癥小體的影響，本研究首先評估補骨脂異黃酮對LPS聯合ATP誘導的NLRP3炎癥小體活性抑制作用是否具有量效關系。

Fig 2 Caspase-1 p20 activity of six isolated compounds from Psoralea corylifolia L n=3)

1:Control;2:Model;3:Psoralen;4:B-methoxypsoralan;5:Xanthotol;6:Angelicin;7:Corylin;8:Psoralidin. The inflammasome activities of six isolated compounds fromPsoraleacorylifoliaL. were tested by Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay. RLU: recombinant luciferase, proportional to caspase-1 activity.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group.

Fig 3 Cell viability of corylin in iBMDM and L02 cells n=3)

細胞培養上清的caspase-1活性檢測結果顯示，補骨脂異黃酮呈濃度依賴性抑制caspase-1活性(Fig 4A)。Western blot檢測結果顯示，補骨脂異黃酮呈濃度依賴性抑制caspase-1 p20的產生和mature IL-1β p17分泌，但是對細胞裂解液中NLRP3、ASC、pro-caspase-1和pro-IL-1β等炎癥小體組成蛋白表達無影響(Fig 4B)。同樣，補骨脂異黃酮也濃度依賴性抑制LPS聯合Nigericin誘導的NLRP3炎癥小體活化以及后續關鍵蛋白caspase-1 p20產生和mature IL-1β p17的分泌(Fig 4C、4D)。上述結果表明，補骨脂異黃酮可抑制ATP和Nigericin誘導NLRP3炎癥小體活化，抑制mature IL-1β介導的免疫炎癥反應。

Fig 4 Effect on ATP, nigericin-induced NLRP3 inflammasome activation inhibited by corylin n=3)

A: LPS-primed iBMDMs treated with various doses of corylin, and then stimulated with ATP. The activity of caspase-1 in culture supernatants (Sup.) was analyzed by Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay. B: Western blot was used to analyze the expression levels of IL-1β p17, caspase-1 p20 in Sup., pro-IL1β, pro-caspase-1, NLRP3, ASC in cell lysates (Lys.). C: LPS-primed iBMDMs stimulated with nigericin after treated with corylin. The activity of caspase-1 in Sup. was analyzed by Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay. D: Western blot was used to analyze the expression levels of IL-1β p17, caspase-1 p20 in Sup., pro-IL1β, pro-caspase-1, NLRP3, ASC in Lys. Coomassie blue staining was provided as the loading control for the Sup. GAPDH was provided as the loading control for the Lys.(B, D).##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

3.4補骨脂異黃酮抑制NLRC4和AIM2炎癥小體活性為明確補骨脂異黃酮對NLRP3炎癥小體的抑制作用是否具有特異性，本研究分別利用LPS聯合沙門氏菌和Poly(dA ∶dT)，構建NLRC4和AIM2炎癥小體活化模型。如Fig 5所示，在LPS聯合沙門氏菌誘導的NLRC4炎癥小體活化模型中，補骨脂異黃酮可抑制pro-caspase-1剪切活化，降低caspase-1 p20的產生，表明補骨脂異黃酮能抑制NLRC4炎癥小體的活化。在LPS聯合dsDNA 類似物Poly(dA ∶dT)誘導的AIM2炎癥小體活化模型中，補骨脂異黃酮能夠降低細胞培養上清中pro-caspase-1剪切活化，降低caspase-1 p20的產生，表明補骨脂異黃酮亦能抑制AIM2炎癥小體活性。而在NLRC4和AIM2炎癥小體活化模型中，補骨脂異黃酮對細胞裂解液中的NLRP3、ASC、pro-caspase-1及pro-IL-1β等蛋白表達均無明顯影響。

3.5補骨脂異黃酮不影響NF-κB信號通路介導的炎癥小體組成蛋白表達為進一步探索補骨脂異黃酮對炎癥小體抑制作用的機制，本研究在iBMDM和LX-2細胞中，評價補骨脂異黃酮是否影響NF-κB信號通路介導的炎癥小體組成蛋白表達。NF-κB信號通路是NLRP3、NLRC4及AIM2炎癥小體激活的第一信號，通過Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)等受體，活化NF-κB信號通路，誘導NLRP3、pro-IL-β、pro-IL-18蛋白表達[11]。Western blot結果顯示(Fig 6)，補骨脂異黃酮對LPS誘導的NLRP3和 pro-IL-1β的表達無明顯影響，同時對pro-caspase-1表達也無影響。ELISA結果進一步提示，補骨脂異黃酮也不影響LPS誘導TNF-α的表達分泌。上述結果表明，補骨脂異黃酮對 NF-κB信號介導的炎癥小體組成蛋白的表達無影響。

Fig 5 NLRC4, AIM2 inflammasome activation inhibited by corylin

Western blot analysis of caspase-1 p20 in Sup., pro-IL-1β, pro-caspase-1, NLRP3, ASC in Lys. of LPS-primed iBMDMs treated with corylin (10 μmol·L-1) and then stimulated with ATP, Salmonella, Poly(dA:dT).

3.6補骨脂異黃酮不可逆地抑制NLRP3炎癥小體的活性本研究為探討補骨脂異黃酮與NLRP3炎癥小體相互作用的性質，研究補骨脂異黃酮對NLRP3炎癥小體的抑制效應是否具有可逆性。LPS預處理的iBMDM細胞，補骨脂異黃酮預孵育0.5 h和1 h，撤去未結合的藥物，再給予ATP刺激，結果顯示，補骨脂異黃酮仍能抑制ATP誘導iBMDM細胞中caspase-1 p20的產生，且與撤藥時間呈相關性，即給予ATP之前，撤去未結合藥物的時間越長，caspase-1 p20的產生越低(Fig 7 A)，表明補骨脂異黃酮對NLRP3炎癥小體抑制作用具有不可逆性。Western blot結果顯示，補骨脂異黃酮對細胞裂解液中NLRP3、ASC、pro-caspase-1 及pro-IL-1β蛋白表達均無明顯影響(Fig 7 B)。

4 討論

炎癥小體作為固有免疫的重要部分，可有效識別病原微生物和機體產生的損傷分子，誘發免疫炎癥反應。NLRP3炎癥小體可識別尼日利亞菌素、二氧化硅、ATP、尿酸鈉結晶等，AIM2炎癥小體能夠被病原微生物或者宿主細胞的dsDNA激活，NLRC4炎癥小體可識別沙門菌中細菌鞭毛蛋白[12]。三種炎癥小體一旦組裝激活，導致pro-caspase-1剪切活化，產生caspase-1 p20，caspase-1 p20進一步剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，使其分別形成成熟的IL-1β和IL-18，導致系列免疫炎癥反應和細胞焦亡，引起損傷。近年研究表明，類風濕性關節炎與NLRP3炎癥小體異常調控密切相關[10]，補骨脂作為傳統骨科用藥，可用于治療類風濕性關節炎這一自身免疫性疾病。因此，本實驗探討補骨脂中單體化合物能否通過調控炎癥小體，減輕免疫炎癥反應，為類風濕關節炎的診斷和治療提供依據。實驗結果表明，補骨脂中補骨脂異黃酮可有效抑制ATP、Nigericin誘導的NLRP3炎癥小體活性，抑制caspase-1 p20的產生及mature IL-1β p17分泌，此外還能抑制NLRC4、AIM2炎癥小體活性，表明補骨脂異黃酮對炎癥小體活性的抑制作用具有廣譜性。這對解釋補骨脂治療類風濕性關節炎這一自身免疫炎癥性疾病具有重要意義，同時為治療炎癥小體活化相關疾病的藥物研發提供新思路和新方法，也為其他炎癥疾病的治療和防控提供借鑒。

Fig 6 NF-κB signaling pathway not

A: iBMDMs were treated with various doses of corylin and then stimulated with LPS. Western blot was used to analyze the protein expressions of pro-IL-1β, NLRP3, pro-caspase-1, ASC in Lys. B: LX-2s were treated with different concentrations of corylin and then incubated with LPS. Western blot was used to analyze the protein expressions of pro-IL-1β, NLRP3, pro-caspase-1, ASC in Lys. GAPDH and tubulin were provided as the loading control for the Lys.(A, B). C: The secretion of TNF-α was measured in the Sup. of iBMDMs by ELISA.##P<0.01vscontrol group.

Fig 7 Activation of NLRP3 inflammasome irreversibly inhibited by corylin n=3)

A: LPS-primed iBMDMs treated with corylin for 0.5 h,1 h and washed three time, then stimulated with ATP for 0.5 h,1 h. Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay was used to analyze the activity of caspase-1 in Sup.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group. B: The protein expressions of caspase-1 p20, pro-caspase-1, pro-IL-1β, NLRP3, ASC were analyzed by Western blot. Coomassie blue staining was provided as the loading control for the Sup. GAPDH was provided as the loading control for the cell Lys.

炎癥小體活化需要兩條信號通路協同完成[13]。第一信號首先TLR4受體與LPS等配體結合，誘導NF-κB信號通路活化，上調NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18等NLRP3炎癥小體組成蛋白的表達。第二信號是活化信號，在ATP、Nigericin等損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs) 和病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)作用下，NLRP3與ASC、pro-caspase-1形成多聚化復合體，誘導pro-caspase-1自我剪切活化，一方面誘導細胞焦亡，另一方面活化的 caspase-1使pro-IL-1β、pro-IL-18剪切為活化的IL-1β、IL-18，并釋放到胞外，參與眾多炎癥反應。本實驗結果表明，補骨脂異黃酮不通過調控 NF-κB 信號通路抑制 NLRP3炎癥小體活性, 而是通過第二條信號通路阻斷caspase-1 p20的產生，抑制caspase-1 p20對 pro-IL-1β的剪切，從而抑制 NLRP3 炎癥小體活性。結合其對NLRC4和AIM2炎癥小體均具有抑制作用，且3種炎癥小體均需要活化caspase-1介導免疫炎癥反應，因此，本實驗認為，補骨脂異黃酮通過調控pro-caspase-1的自我剪切發揮作用。

本研究尚未評價補骨脂異黃酮在小鼠骨髓來源的原代巨噬細胞和NLRP3炎癥小體相關動物模型中的作用，同時尚未考慮補骨脂異黃酮在機體的生物轉化度，若轉化成其他代謝產物，是否能同樣調控炎癥小體，有待進一步探討。

炎癥小體的異常活化導致多種免疫炎癥性疾病的發生和發展。近年來，如MCC950[14]、燈盞花乙素[15]等均通過抑制NLRP3炎癥小體活化，發揮抗炎作用。因此，開發可調控炎癥小體的小分子化合物，對于防治炎癥小體相關疾病具有重要意義。