萘醌衍生物抗血管平滑肌細胞增殖的活性研究

張偉云，王曉禹，王麗榮，許長江，溫忠秀

(廈門醫(yī)學院藥學系，福建省中藥精加工與健康產(chǎn)品開發(fā)重點研究室，福建 廈門 361023)

血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)由激活的巨噬細胞、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)和內皮細胞產(chǎn)生，形成3個亞型(AA、AB、BB)，在各種血管疾病的發(fā)病和發(fā)展中起著重要作用[1-2]。PDGF-BB引起VSMCs過度增殖是動脈粥樣硬化和相關血管疾病的標志[3]。因此，抑制PDGF-BB誘導的VSMCs增殖是預防和治療血管疾病的重要策略。PDGF-BB與PDGF受體結合，激活PI3K/Akt、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1，PLCγ1)和細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)信號轉導途徑[1]。因此，抗增殖作用可能通過調控PI3K/Akt、PLCγ1、ERK1/2信號通路而實現(xiàn)。VSMCs增殖是由細胞周期控制的，細胞周期包括處于休止期(G0)和細胞生長間期即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、細胞分裂期(M期)[2]。

紫草醌是從中藥紫草中提取的一種萘醌類化合物，對大鼠VSMCs有抗增殖活性，研究者報道了紫草醌抑制TNF-α誘導的大鼠VSMCs生長[4]。一些萘醌類衍生物具有抗增殖活性。2-氯-3-(4-苯基)-氨基1，4-萘醌抑制了胎牛血清誘導的大鼠主動脈VSMCs增殖。2-氯-3-[4-(乙基羧基)-苯基)]-氨基-1，4-萘醌抑制了PDGF-BB刺激的大鼠主動脈VSMCs DNA合成，并通過抑制PDGFβ受體(PDGFRβ)的活性而抑制細胞周期進程[3]。

在本研究中，我們實驗室合成的一系列萘醌衍生物中的2-壬基硫酰-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌(2-nonylsulfinyl-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinone, 2-nonylsulfinyl-DMNQ,結構見Fig 1)，表現(xiàn)出抑制由PDGF-BB刺激的大鼠主動脈VSMCs增殖的活性。為了研究萘醌類化合物潛在的抗VSMCs增殖的作用機制，本課題對PDGF-BB介導的相關信號通路如ERK1/2、Akt、PLCγ1、PDGFβ受體，以及細胞周期進程和細胞周期調控蛋白進行了研究。

Fig 1 Chemical structure of 2-nonylsulfinyl-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinone(2-nonylsulfinyl-DMNQ)

1 材料

1.1藥物與試劑2-nonylsulfinyl-DMNQ，由本實驗室合成，純度>98%。PDGF-BB購自Upstate Biotechnology公司；抗體GAPDH、p-Akt1/2/3(Ser 473)-R、Akt，購自Santa Cruz生物技術公司；抗體p-PDGFRβ(Tyr751)、p-p44/42 MAPK(ERK1/2) (Thr202/Tyr204)、p-PLCγ1(Tyr783)、PDGFRβ、p44/42 MAPK(ERK1/2)、PLCγ1，均購自Cell Signaling Technology公司；Akt抑制劑LY294002，購自Cayman Chemical 公司；PDGFRβ抑制劑AG1295、ERK抑制劑U0126、PLCγ抑制劑U73122，均購自Sigma-Aldrich公司；Premix WST-1細胞增殖測試試劑盒，購自TaKaRa公司；其他化學試劑均為分析級。

1.2細胞株大鼠主動脈血管平滑肌細胞A10，型號FS-1629，購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.3儀器IFS-110-8型CO2恒溫培養(yǎng)箱(新加坡Esco Micro Pte有限公司)；Multiskan Go型全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；LS3801型液體閃爍計數(shù)器(德國Beckman Düsseldorf公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)A10細胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5～9代的細胞用于實驗。

2.2細胞增殖實驗采用非放射性比色法WST-1和細胞計數(shù)法，測定了2-nonylsulfinyl-DMNQ對A10細胞的抗增殖作用。以2.5×107·L-1的濃度將A10細胞接種于96孔培養(yǎng)板，并在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。接著用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，再分別用含0.1、0.5、1 μmol·L-12-nonylsulfinyl-DMNQ的無血清DMEM培養(yǎng)液處理24 h， 再加入25 μg·L-1的PDGF-BB 培養(yǎng)22 h，最后加入WST-1培養(yǎng)2 h后，于450 nm波長下測定細胞光密度。

進一步用細胞計數(shù)實驗證明2-nonylsulfinyl-DMNQ的抗增殖作用。以5×107·L-1的濃度將A10細胞接種于6孔培養(yǎng)板，并在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，再用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，接著分別用0.1、0.5、1 μmol·L-1的2-nonylsulfinyl-DMNQ處理24 h后，用25 μg·L-1的PDGF-BB處理24 h。最后，細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，置于顯微鏡下，使用血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞個數(shù)。

為排除假陽性，使用WTS-1試劑盒測試2-nonylsulfinyl-DMNQ對A10細胞的細胞毒性, 洋地黃毒苷(25 μmol·L-1)作為對照藥物。A10細胞在無血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，分別加1 μmol·L-12-nonylsulfinyl-DMNQ處理0、3、6、12、24、48 h，而后細胞加入WST-1培養(yǎng)2 h，于450 nm波長下測定和記錄相應的光密度值。

2.3[3H]胸腺嘧啶核苷參入實驗參照文獻方法[5]，利用[3H]胸腺嘧啶核苷參入法測定2-nonylsulfinyl-DMNQ對DNA合成的作用。A10細胞用25 μg·L-1的PDGF-BB處理20 h后，再用1 mCi·L-1[3H]胸腺嘧啶核苷處理4 h。使用液體閃爍計數(shù)器來量化[3H]胸腺嘧啶核苷的參入量。

2.4細胞周期進程分析按照文獻描述方法[5]確定細胞周期。用0.1、0.5、1 μmol·L-1的2-nonylsulfinyl-DMNQ處理A10細胞24 h，再用25 μg·L-1的PDGF-BB刺激24 h后收集、清洗細胞，然后用70%乙醇于4 ℃固定30 min。再將細胞混勻后離心，棄去上清液，在室溫下將細胞放置于300 μL的碘化丙錠溶液(50 mg·L-1碘化丙錠的樣品緩沖液中含有100 mg·L-1核糖核酸酶A)15 min。每個細胞核的碘化丙錠-DNA復合體用流式細胞儀測量。通過程序Modfit LT分析確定細胞周期G0/G1、S和G2/M階段的比例。

2.5免疫印跡分析參照文獻方法[5]進行免疫印跡分析。將A10細胞以5×107·L-1的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)24 h，再用無血清的DMEM培養(yǎng)24 h，接著分別用2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1、0.5、1 μmol·L-1)、10 μmol· L-1ERK1/2抑制劑U0126[6]、10 μmol·L-1PI3K抑制劑LY294002[7]、20 μmol·L-1PLCγ抑制劑U73122[8]、20 μmol·L-1PDGFRβ抑制劑AG1295[9]處理24 h。用25 μg·L-1的PDGF-BB刺激A10細胞15 min后，檢測ERK1/2、Akt、PLCγ1和PDGFRβ的磷酸化水平。蛋白樣品用SDS-PAGE分離，分別使用相應的抗體進行免疫印跡分析，使用ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)和Bio-Rad的MultiAnalist軟件對免疫印跡分析中的條帶進行密度可視化和測量。

Fig 3 Effect of 2-nonylsulfinyl-DMNQ

A:[3H]thymidine incorporation.[3H]thymidine uptake into DNA of A10 cells was quantified using a liquid scintillation counter; B: Cell cycle progression. The individual nuclear DNA content was reflected by fluorescence intensity of incorporated PI. Each item was derived from a representative experiment, where data from at least 10, 000 events were obtained.**P<0.01vsPDGF-BB group.

3 結果

3.12-nonylsulfinyl-DMNQ對A10細胞增殖的影響如Fig 2A所示，與無血清培養(yǎng)液對照組相比，經(jīng)過25 μg·L-1的PDGF-BB刺激后的A10細胞生長明顯加快，2-nonylsulfinyl-DMNQ以濃度依賴的方式抑制PDGF-BB引起的A10細胞增殖。Fig 2B細胞計數(shù)實驗結果顯示，與無刺激組(5.7×107·L-1)相比，25 μg·L-1PDGF-BB處理組(12.4×107·L-1)細胞的數(shù)量明顯增加；經(jīng)2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1、0.5、1 μmol·L-1)處理，細胞明顯減少至8.4×107·L-1、7.5×107·L-1、6.9×107·L-1。

Fig 4 Effect of 2-nonylsulfinyl-DMNQ on PDGF-BB stimulated phosphorylation of ERK1/2(A), Akt(B), PLCγ1(C) and

**P<0.01vsPDGF-BB group

圖2C結果顯示，細胞經(jīng)過1 μmol·L-12-nonylsulfinyl-DMNQ處理48 h后，并未出現(xiàn)任何細胞毒性，提示2-nonylsulfinyl-DMNQ抗細胞增殖的作用不是由于細胞毒性。

3.22-nonylsulfinyl-DMNQ對[3H]胸腺嘧啶核苷參入的影響PDGF-BB引起[3H]胸腺嘧啶核苷參入由641 cpm/孔增加到4 358 cpm/孔。經(jīng)過2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1、0.5、1 μmol·L-1)處理，明顯抑制了PDGF-BB引起的[3H]胸腺嘧啶核苷進入DNA， 抑制率分別是16.6%、43.3%、66.9%(Fig 3A)。

3.32-nonylsulfinyl-DMNQ對細胞周期進程的作用通過細胞周期的分布(Fig 3B)可以看出，PDGF-BB引起S期細胞的比例由7.4%增加到14.9%。2-nonylsulfinyl-DMNQ處理能阻止細胞周期進程，減少處于S期細胞的百分比，其抗細胞增殖作用與增加處于G0/G1的細胞有關。

3.42-nonylsulfinyl-DMNQ對PDGF-BB引起的Akt、PLCγ1、PDGFRβ磷酸化的作用Fig 4結果顯示，PDGF刺激的ERK1/2磷酸化水平被10 μmol·L-1ERK抑制劑U0126降低到PDGF-BB誘導的對照組的39.1%；用2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.5、1 μmol·L-1)處理后，ERK1/2磷酸化水平分別降低到74.3%和51.6%。1 μmol·L-12-nonylsulfinyl-DMNQ和10 μmol·L-1PI3K抑制劑 LY294002處理細胞后, 均明顯抑制了由PDGF-BB引起的Akt磷酸化。20 μmol·L-1PLCγ1抑制劑U73122明顯降低由PDGF-BB介導的PLCγ1磷酸化水平，降低至PDGF-BB刺激對照組的3.3%；2-nonylsulfinyl-DMNQ在0.1～1 μmol·L-1濃度范圍內，明顯降低了PLCγ1磷酸化水平。20 μmol·L-1PDGFRβ抑制劑AG1295處理后，PDGF-BB刺激的PDGFRβ磷酸化水平被明顯抑制到PDGF-BB刺激對照組的14.7%；2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.5、1 μmol·L-1)均能明顯抑制PDGFRβ磷酸化水平。

4 討論

動脈壁中VSMCs的過度增殖是血管疾病的重要病理因素[10]。因此，抑制VSMCs增殖是針對這類疾病的重要治療策略之一[11]。本研究結果顯示，2-nonylsulfinyl-DMNQ明顯抑制PDGF-BB引起的VSMCs增殖、DNA合成，其抗增殖作用與G0/G1期抑制有關。

PDGF-BB與PDGF受體結合，導致PDGFRβ酪氨酸殘基磷酸化，刺激PI3K/Akt、ERK1/2和PLCγ1的激活[1,3]。PDGF、Akt、ERK1/2和PLCγ1的磷酸化水平降低可能會抑制PDGF-BB刺激的VSMCs增殖。ERK1/2是細胞生長早期細胞內的有絲分裂信號轉導的重要參與者，并且與PDGF-BB誘導的各種細胞類型的增殖有關。Akt是另一個與PDGF-BB介導的增殖有關的下游信號。本實驗結果表明，2-nonylsulfinyl-DMNQ以濃度依賴性的方式抑制PDGF-BB刺激的ERK1/2、Akt、PLCγ1、PDGFRβ的磷酸化，提示其抗增殖作用可能通過抑制上述信號分子的磷酸化來調節(jié)。

綜上所述，2-nonylsulfinyl-DMNQ通過抑制ERK、Akt、PLCγ1和PDGFRβ路徑，通過在G0/G1期阻滯細胞周期進入S期，從而減少了DNA合成，最終抑制了PDGF-BB誘導的VSMCs增殖。因此，2-nonylsulfinyl-DMNQ可能具有通過抑制VSMCs增殖來預防和治療動脈粥樣硬化的潛力。深入探索2-nonylsulfinyl-DMNQ抑制VSMCs增殖的作用機制，將為該化合物在防治動脈粥樣硬化的應用提供實驗依據(jù)。