ABT-737增強(qiáng)Mcl-1小分子抑制劑UMI-77誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡

吳 萍，李佳佳，裴新茹，陳 坤，胡汪來(lái)

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

Bcl-2家族蛋白是線粒體凋亡途徑重要的調(diào)控者，其中抗凋亡蛋白包括B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma，Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤超大蛋白(B-cell lymphoma extra large，Bcl-xL)、髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)、Bcl-w和A1。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞生存及耐藥的重要機(jī)制之一，因此，抑制抗凋亡蛋白能達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。“BH3-only”蛋白是天然的抗凋亡蛋白的抑制劑，但很難通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)直接得到，因此，人們用模擬“BH3-only”蛋白的小分子化合物來(lái)抑制抗凋亡蛋白，由此誕生了BH3類(lèi)似物(BH3 mimetics)的概念。自2005年以來(lái)，BH3類(lèi)似物成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，大量的小分子化合物不斷涌現(xiàn)，如抑制Bcl-2/Bcl-xL的ABT-737及其口服衍生物ABT-263、抑制Bcl-2的ABT-199等。對(duì)于那些依賴Bcl-2和/或Bcl-xL存活的腫瘤細(xì)胞而言，這些BH3類(lèi)似物的效果很好，但一些腫瘤細(xì)胞由于高表達(dá)Mcl-1而對(duì)它們抵抗[1]，因此，研發(fā)出能選擇性抑制Mcl-1的BH3類(lèi)似物很有必要。UMI-77是2014年通過(guò)高通量篩選方法鑒定出來(lái)的Mcl-1小分子抑制劑，在胰腺癌的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都有很好的效果[2]。本研究將UMI-77應(yīng)用到胃癌細(xì)胞，在對(duì)UMI-77抵抗的胃癌細(xì)胞中，將UMI-77和Bcl-2/Bcl-xL的抑制劑ABT-737聯(lián)用，觀察聯(lián)用后的細(xì)胞凋亡情況，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；UMI-77、ABT-737，購(gòu)自Selleck公司；MTS購(gòu)自Promega公司；FITC Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自BD Pharmingen公司；MitoProbe JC-1試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；抗pro-caspase-3、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly [ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1)、Survivin、Bcl-2和Mcl-1單克隆抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司；抗cleaved-caspase-3、caspase-9、X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1)、cIAP2、Bcl-xL、Bim、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)單克隆抗體，購(gòu)自Cell Signaling公司；抗NOXA單克隆抗體，購(gòu)自Abcam公司；抗GAPDH單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio Tek公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀(Bio-Rad公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞MGC-803、HGC-27，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于96孔板(每孔100 μL)，次日細(xì)胞匯合度達(dá)70%，加入不同濃度的UMI-77、ABT-737或同時(shí)加入U(xiǎn)MI-77和ABT-737，對(duì)照組加入含有與藥物組同等含量的DMSO，調(diào)零孔僅加等體積的培養(yǎng)液、無(wú)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。處理48 h或24 h后，每孔加10 μL MTS，37 ℃避光孵育1～4 h，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)主波長(zhǎng)為490 nm、參考波長(zhǎng)為630 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.2.3Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于24孔板，次日細(xì)胞匯合度達(dá)70%，分別加UMI-77(10 μmol·L-1)、ABT-737(10 μmol·L-1)、UMI-77(10 μmol·L-1)+ABT-737(10 μmol·L-1)處理，對(duì)照組(Control)加入含有與處理組同等含量的DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后，分別收集孔中的上清至流式管中，貼壁的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化下來(lái)，也收集到對(duì)應(yīng)的流式管中。用冷PBS洗2次，每管細(xì)胞沉淀中加100 μL 1×binding buffer，充分吹打混勻。每管加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光染色15 min，最后每管加400 μL 1×binding buffer，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析結(jié)果，以Annexin V(+)細(xì)胞所占比例定為細(xì)胞凋亡率。

1.2.4JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位(Δψm)的變化 種板、處理及收集步驟同“1.2.3”，每管細(xì)胞沉淀中加1 mL溫PBS重懸，陽(yáng)性對(duì)照管加1 μL 50 mmol·L-1的碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)(終濃度為50 μmol·L-1)，37 ℃避光處理5 min。然后每管加2.5 μL 200 μmol·L-1的JC-1(終濃度為0.5 μmol·L-1)，37 ℃避光染色30 min。每管加2 mL 溫PBS洗1次，最后每管加500 μL溫PBS重懸，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)ΔΨm的變化情況。FlowJo 7.6軟件分析結(jié)果，當(dāng)ΔΨm較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光。當(dāng)ΔΨm較低時(shí)，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。

1.2.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集對(duì)照組(Control)、UMI-77(10 μmol·L-1)、ABT-737(10 μmol·L-1)、UMI-77(10 μmol·L-1)+ABT-737(10 μmol·L-1)處理24 h的細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000×g離心30 min后，取上清，即細(xì)胞總蛋白。采用BCA法蛋白定量，取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含50 g·L-1脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜；次日用TBST洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。ECL顯色，在化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光成像。應(yīng)用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1HGC-27細(xì)胞對(duì)UMI-77不敏感用UMI-77(1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)處理MGC-803和HGC-27細(xì)胞48 h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率。Fig 1結(jié)果顯示，MGC-803細(xì)胞對(duì)UMI-77很敏感，隨著UMI-77濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；而HGC-27細(xì)胞對(duì)UMI-77抵抗，20 μmol·L-1以下的濃度幾乎對(duì)細(xì)胞存活無(wú)影響，只有在濃度高達(dá)50 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞才大量死亡。

Fig 1 Effect of UMI-77 on viability of gastric cancer MGC-803 and HGC-27 cells n=6)

**P<0.01vscontrol

2.2UMI-77和ABT-737聯(lián)用能明顯增加HGC-27細(xì)胞死亡在對(duì)UMI-77不敏感的HGC-27細(xì)胞中，分別將UMI-77(1、2、5、10 μmol·L-1)與10 μmol·L-1的ABT-737聯(lián)用24 h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率。如Fig 2A所示，10 μmol·L-1的ABT-737與UMI-77(1、2、5、10 μmol·L-1)聯(lián)用時(shí)，能明顯降低細(xì)胞存活率，與單用UMI-77或單用ABT-737相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，如Fig 2B所示，10 μmol·L-1UMI-77與10 μmol·L-1ABT-737聯(lián)用24 h后，Annexin V (+)細(xì)胞所占的比例明顯增多，且其中大部分死細(xì)胞都位于右下象限，說(shuō)明確實(shí)發(fā)生了凋亡。

2.3UMI-77和ABT-737聯(lián)用激活了線粒體凋亡途徑JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm)的變化，F(xiàn)ig 3A結(jié)果顯示，10 μmol·L-1UMI-77或10 μmol·L-1ABT-737單獨(dú)處理24 h時(shí)Δψm較高，JC-1大多處于聚合狀態(tài)，而UMI-77和ABT-737聯(lián)用后Δψm急劇下降。Western blot結(jié)果顯示(Fig 3B)，UMI-77單用時(shí)caspases不激活，ABT-737單用時(shí)，caspases有一定程度的活化，但UMI-77和ABT-737聯(lián)用后，caspase-9、caspase-3和PARP-1的裂解更加明顯，表現(xiàn)為pro-caspase-9、pro-caspase-3和PARP-1的表達(dá)水平降低，同時(shí)cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP-1出現(xiàn)，說(shuō)明UMI-77和ABT-737聯(lián)用是通過(guò)線粒體途徑導(dǎo)致HGC-27細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.4IAP家族和Bcl-2家族在UMI-77和ABT-737聯(lián)用中的作用Western blot檢測(cè)IAP家族和Bcl-2家族在單用或聯(lián)用UMI-77與ABT-737前后的表達(dá)情況，如Fig 4所示，IAP家族中的XIAP、cIAP1和cIAP2在UMI-77與ABT-737聯(lián)用時(shí)下降，其中以XIAP和cIAP2的下降尤為明顯，Survivin的表達(dá)沒(méi)有變化；“BH3-only”蛋白中的NOXA明顯增高，PUMA明顯降低，抗凋亡蛋白中的Bcl-2略有升高、Mcl-1略有下降，但變化的程度很有限，而B(niǎo)cl-xL和Bim沒(méi)有任何改變。

3 討論

以Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的小分子抑制劑，被稱為BH3類(lèi)似物，是一類(lèi)新的抗腫瘤制劑，目前，研究得較為清楚的是ABT-737、ABT-263、ABT-199等。ABT-737和ABT-263在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都具有很好的抗腫瘤活性，已進(jìn)入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。ABT-199在2016年4月經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)已經(jīng)上市，用于染色體17p缺失的慢性淋巴細(xì)胞白血病的治療，是第1個(gè)進(jìn)入臨床的BH3類(lèi)似物，這一具有里程碑意義的事件，極大地激發(fā)了人們研究BH3類(lèi)似物的熱情。

Fig 2 Effect of treatment with UMI-77 plus ABT-737 on cell death in HGC-27 cells n=6)

A: Cell viability after treatment with UMI-77, ABT-737 alone or combination for 24 h; B: Apoptotic rate after treatment with UMI-77 plus ABT-737 for 24 h.**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs 10 μmol·L-1UMI-77;△△P<0.01 vs 10 μmol·L-1ABT-737.

Mcl-1是抗凋亡蛋白里比較獨(dú)特的成員，它只含有Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域1～3(Bcl-2 homology domain，BH1～3)，盡管如此，它的分子量卻最大，由350個(gè)氨基酸殘基組成。其氨基端含有2個(gè)脯氨酸/谷氨酸/絲氨酸/蘇氨酸(proline/glutamic acid/serine/threonine，PEST)序列，使得Mcl-1半衰期很短(<1～4 h)。Mcl-1在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后相關(guān)[3]。利用基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)翻譯的抑制劑[4]或RNA干擾[5]辦法下調(diào)Mcl-1，能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物或BH3類(lèi)似物(ABT-737、ABT-199等)的敏感性，因此，研發(fā)出能特異性抑制Mcl-1的BH3類(lèi)似物很有必要。

Fig 3 Effect of combination of UMI-77 with ABT-737 on mitochondrial membrane potential and caspases activation n=3)

A: Effect on the mitochondrial membrane potential using JC-1 staining by flow cytometry; B: Activation of caspase-9, caspase-3 and PARP-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 4 Effect of treatment with UMI-77, ABT-737, either alone or in combination, on expression levels of IAP family and Bcl-2 family members n=3)**P<0.01 vs control

與針對(duì)Bcl-2和Bcl-xL的抑制劑相比，Mcl-1抑制劑的研究稍顯滯后，最近幾年才陸續(xù)出現(xiàn)幾個(gè)選擇性針對(duì)Mcl-1的小分子抑制劑，如Maritoclax[6]、UMI-77、A-1210477[7]和S63845[8]。UMI-77是2014年Abulwerdi等[2]鑒定出的一種選擇性的Mcl-1抑制劑，能與Mcl-1的BH3結(jié)合槽結(jié)合，阻止Mcl-1/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)和Mcl-1/Bcl-2同源拮抗者(Bcl-2 homologous antagonist killer，Bak)復(fù)合物形成，經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在胰腺癌異種移植物重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠模型中，UMI-77也顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤活性，且對(duì)周?chē)M織無(wú)毒性。此外，UMI-77能增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[9]，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[10]和食管鱗癌[11]中，將UMI-77與TRAIL或順鉑聯(lián)用也能誘導(dǎo)更明顯的細(xì)胞凋亡。

本研究將UMI-77作用于兩株胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MGC-803細(xì)胞對(duì)之很敏感，單獨(dú)使用就可以達(dá)到很好的效果，而HGC-27細(xì)胞對(duì)之抵抗，因此，如何克服HGC-27細(xì)胞對(duì)UMI-77的抵抗就是本研究的重點(diǎn)。HGC-27細(xì)胞對(duì)低濃度的ABT-737也不太敏感，但是當(dāng)UMI-77和ABT-737聯(lián)用后，細(xì)胞存活率明顯下降，超過(guò)一半的細(xì)胞表現(xiàn)為Annexin V(+)，且其中的絕大多數(shù)位于右下象限，說(shuō)明細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了凋亡。此外，前體形式的pro-caspase-9、pro-caspase-3和PARP-1明顯減少，與之相伴著裂解形式的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3及cleaved-PARP-1出現(xiàn)，說(shuō)明caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活；線粒體膜電位的下降，說(shuō)明線粒體參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程，這些都充分證實(shí)UMI-77和ABT-737聯(lián)用是通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞發(fā)生凋亡。

為了了解凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白在UMI-77和ABT-737聯(lián)用中的作用，觀察Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)、“BH3-only”蛋白(Bim、PUMA、NOXA)，以及IAP家族中的XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)XIAP、cIAP1和cIAP2在聯(lián)用時(shí)明顯下調(diào)。IAP家族是一組內(nèi)源性的抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，包括XIAP、cIAP1、cIAP2、Survivin等8個(gè)成員。XIAP能直接結(jié)合到caspase-9、caspase-7和caspase-3上，從而抑制它們的活性，而凋亡發(fā)生時(shí)，從線粒體釋放出來(lái)的第2個(gè)線粒體來(lái)源的caspases激活劑(second mitochondria-derived activator of caspases，SMAC)能解除XIAP對(duì)caspases的抑制。cIAP1和cIAP2能以高親和力結(jié)合SMAC，阻止SMAC對(duì)XIAP的抑制作用，從而間接地抑制caspases。越來(lái)越多的證據(jù)表明，IAP家族在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其下調(diào)或失活會(huì)引起凋亡的增加[12]，本研究中，XIAP、cIAP1和cIAP2的下降可能正是導(dǎo)致凋亡增加的關(guān)鍵因素。抗凋亡蛋白Bcl-2升高和Mcl-1降低的程度很有限，而“BH3-only”蛋白NOXA的上調(diào)和PUMA的下調(diào)卻十分明顯。“BH3-only”蛋白啟動(dòng)凋亡是通過(guò)直接激活Bax/Bak，或者抑制抗凋亡蛋白的作用來(lái)達(dá)成。如Bim、PUMA能抑制Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1，而NOXA只能抑制Mcl-1[13]。抗凋亡蛋白抑制凋亡主要是通過(guò)隔離“BH3-only”蛋白，或者阻止Bax/Bak發(fā)生同源寡聚化。在本研究中，“BH3-only”蛋白與抗凋亡蛋白之間究竟有著怎樣復(fù)雜的相互作用尚不清楚，可能是NOXA的增加抑制了Mcl-1，另外，Bcl-2的增加又導(dǎo)致了PUMA的下降，這些問(wèn)題還需要今后進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，不同的胃癌細(xì)胞對(duì)Mcl-1小分子抑制劑UMI-77的敏感性不同，對(duì)于那些對(duì)UMI-77抵抗的細(xì)胞，可以通過(guò)與Bcl-2/Bcl-xL抑制劑ABT-737聯(lián)用的方式來(lái)增強(qiáng)殺傷效應(yīng)，兩者聯(lián)用能更有效地激活線粒體凋亡途徑。本研究的結(jié)果將有望拓展Mcl-1小分子抑制劑在更多實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用，為此類(lèi)抑制劑最終進(jìn)入臨床提供理論依據(jù)。