蛋白酶體抑制劑MG132對急性髓系白血病細胞增殖與凋亡的影響

鄭曉輝，黃家福，徐淑娟，李 鑫，許雅蘋，房純正，翁樂斌，汪 潔，黃黎月

(1. 廈門醫學院基礎醫學部生理學教研室，機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室,福建 廈門 361023；2. 福建醫科大學附屬協和醫院血液科,福建 福州 350001；3. 廈門醫學院基礎醫學部病理學教研室,福建 廈門 361023)

黏附調節分子1(adhesion regulating molecule 1, ADRM1)亦被稱為 hRpnl3(human Rpn13)。ADRM1基因位于20號染色體長臂13區(20q13)上，包含9個外顯子，可轉錄成兩個轉錄本，編碼同一種蛋白ADRM1。研究者在對多細胞真核生物內ADRM1的保守性分析中發現ADRM1高度保守，說明 ADRM1可能在生命過程中發揮重要功能[1-2]。研究顯示，ADRM1蛋白是26S蛋白酶體亞單位19S調節顆粒上一個受體[3-4]，決定26S蛋白酶體結構不對稱性[5]。它分為3個功能性區域：N-端、C-端和插入片段。ADRM1通過N-端結合到19S調節顆粒的Rpn2和Rpn10亞基上，而通過C-端尾9個α螺旋與泛素羧端水解酶37(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 37, UCH37)上卷曲螺旋的C-端相互作用，募集UCH37到蛋白酶體上，并將其活化，形成 ADRM1/UCH37復合物，進入蛋白酶體泛素化路徑，介導NF-κB、TGF-β I型受體、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)等底物蛋白的降解[6-8]。

已有研究表明[9-12]，ADRM1在結腸癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤中處于過表達狀態，是驅動20ql3區基因高拷貝擴增的主要基因。本實驗組前期研究發現，ADRM1基因在裸鼠體內不同致瘤率HL60細胞內存在表達差異(≥2倍)，在急性白血病(acute leukemia, AL)細胞中表達上調[13]。因此，本實驗首先通過了解ADRM1在實驗室白血病細胞株中表達；其次，觀察ADRM1干擾后HL60細胞增殖變化；最后，鑒于蛋白酶體抑制劑是臨床多發性骨髓瘤(multiple yeloma, MM)常用藥，效果明顯；MG132(結構見Fig 1)也稱Z-LLL-CHO、Z-Leu-Leu-Leu-CHO、Z-Leu-Leu-Leu-al或Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal，是一種常用的蛋白酶體抑制劑，可抑制泛素蛋白酶體途徑活性，上調caspase-3表達，誘導肝癌細胞HepG2凋亡[14]，本實驗擬通過觀察HL60、NB4細胞在不同濃度MG132作用下增殖與凋亡，同時檢測HL60細胞內ADRM1、UCH37蛋白表達，了解ADRM1在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本 AL患者初治骨髓標本(AL-untreated)、AL患者完全緩解骨髓標本(AL-complete remission, AL-CR)、臍帶血標本來自2010年9月至2014年5月期間，福州協和醫院門診和住院收治患者。確診根據FAB分型及張之南《血液病診斷及療效標準》。以上樣本經患者書面知情同意獲得，并經中華醫德委員會和福建醫科大學聯合醫院信托基金批準使用。

Fig 1 Chemical structure of MG132

1.1.2細胞株 人急性早幼粒細胞白血病細胞NB4、人急性單核細胞白血病細胞THP1、人B淋巴細胞白血病細胞 Ball、人急性T淋巴細胞白血病細胞Jurkat、人急性淋巴母細胞性白血病細胞Molt-4、人慢性髓系白血病細胞K562、人多發性骨髓瘤細胞U266、人組織細胞淋巴瘤細胞U937，由福建省血液病重點實驗室饋贈；人急性粒細胞白血病部分分化型細胞 HL60，購自上海富衡細胞公司；大腸桿菌E.coli DH5α、293T細胞為本實驗室保存。

1.1.3試劑 人淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；TRIzol reagent(Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(Promega公司)；Oligo Primers(上海生工)；SYBR Green Master(ROX)(Roche公司)；酶切酶、連接酶(NEB)；質粒抽提試劑盒(碧云天)；MG132(Sigma)；CCK-8(Yeasen)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche)；Western blot 抗體(CST公司)；CD34+抗體(BD)。

1.1.4儀器 二氧化碳細胞培養箱2323-2(SHELLAB公司)；倒置顯微鏡37XA(上海光學儀器廠)；流式細胞分選儀FACS Aria(美國BD 公司)；熒光倒置顯微鏡DMLB(德國徠卡公司)；Gene Amp 2400 PCR 擴增儀、實時熒光定量PCR儀7500(美國應用生物系統公司)；流式細胞儀EPICSXL(貝克曼庫爾特公司)；電泳儀PowerPac HC(Bio-Rad公司)；快速Westrn blot儀器MA01821(Millipore)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR法檢測CD34+AL細胞、造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、AL-CR標本、血液腫瘤細胞株內ADRM1 mRNA表達 TRIzol抽提細胞內RNA，于1%瓊脂糖電泳分離，EB染色,在紫外光透射儀中觀察，拍照28 S RNA和18 S RNA ，確定其比值。當28 S/18 S約為2 ∶1時，說明RNA穩定并且無降解，逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，用于實時定量PCR實驗。利用DNAMAN軟件設計引物，由上海英駿生物技術有限公司及上海生工公司合成，引物序列如下：ADRM1上游引物5′-AAGCGGAAAGGGCTGGTGTA-3′，下游引物5′-GCAATGCTCCTCATCCTGGT-3′，擴增片段長度240 bp；以β-actin為對照基因，其上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAA-3′，下游引物5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，擴增片段長度220 bp。

1.2.2構建ADRM1 shRNA與scrambled shRNA慢病毒感染HL60細胞 利用DNAMAN軟件，與上海吉瑪公司(Genepharma)共同設計并合成有效siRNA干擾序列3條及陰性對照序列1條，利用Lipofectamine 2000瞬時轉染HL60細胞，qRT-PCR法篩選最有效干擾序列。上海吉凱公司合成靶序列(ADRM1-shRNA)及陰性對照序列(scrambled shRNA)相應各1對單鏈DNA，退火合成雙鏈 shDNA，經酶切連接到帶GFP篩選標記的慢病毒干擾載體GV115上，之后通過CaCl2沉淀法轉導到感受態DH5α內，進行質粒擴增，之后質粒抽提試劑盒抽提質粒，經雙酶切鑒定后，送上海英駿生物技術有限公司測序，得到ADRM1 shRNA與scrambled shRNA慢病毒干擾載體。由上海吉凱基因化學技術有限公司包裝成ADRM1 shRNA與scrambled shRNA慢病毒，并進行病毒滴度濃縮。慢病毒感染HL60細胞，流式細胞分選儀分選GFP陽性HL60細胞，多次流式篩選，得到穩定ADRM1 shRNA與scrambled shRNA HL60細胞株。

1.2.3細胞增殖/毒性實驗 在96孔板中接種100 μL 細胞懸液(細胞增殖實驗5×107·L-1；細胞毒性實驗1×108·L-1)，于37 ℃、5% CO2培養箱預培養24 h；向培養板加入10 μL不同濃度的MG132，孵育24、48、72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培養箱內孵育3 h；用酶標儀測定在450/630 nm處的吸光度。

1.2.4Annexin V FLUOS Staining Kit流式細胞術檢測細胞凋亡 用 Annexin V FLUOS Staining Kit檢測細胞凋亡率。收集細胞于5 mL PBS中，800 r·min-1離心5 min， 棄上清，預冷的PBS洗2次，之后按說明書操作。

1.2.5Western blot檢測細胞內蛋白表達 收集各組細胞，PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正釩酸鈉、10 mg·L-1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度，取40 μg總蛋白進行Western blot實驗。10% SDS-PAGE電泳后，行轉膜印跡，分別用β-actin、ADRM1、UCH37一抗體與膜上的抗原結合，然后用HRP偶聯的二抗與其反應，用ECL化學發光試劑檢測，經壓片曝光后，顯影和定影。比較各組蛋白表達情況。

2 結果

2.1ADRM1mRNA在血液腫瘤細胞株的表達以急性白血病完全緩解患者骨髓標本(AL-CR)、臍帶血干細胞標本(HSCs)為對照，結果如Fig 2所示：急性白血病初治患者骨髓標本(AL-untreated)、急性白血病初治患者骨髓 CD34+細胞標本(CD34+AL cells)、急性髓系白血病細胞株(NB4、THP1、HL60)、急性淋系白血病細胞株(Ball、Molt-4、Jurkat)、慢性髓系白血病細胞(K562)、組織細胞淋巴瘤細胞 U937與多發性骨髓瘤細胞(U266)內，ADRM1 mRNA表達明顯上調；實驗室細胞株內ADRM1表達普遍高于急性白血病初治患者骨髓標本內 ADRM1 表達。

Fig 2 Comparison of expression of ADRM1 mRNA in blood tumor cell lines

RQ=2-ΔΔCT

2.2qRT-PCR篩選有效靶序列qRT-PCR法檢測siRNA瞬轉后，HL60細胞內ADRM1 mRNA表達水平，以分析不同靶序列siRNA的干擾有效性。HL60細胞RNAi 48 h后，β-actin與ADRM1基因的qRT-PCR結果見Tab 1。353靶點siRNA沉默有效率約0.67(有效率=1-2-ΔΔCT)，1044靶點siRNA則為0.49，所以選擇353靶點siRNA設計shRNA。

Tab 1 Expression of ADRM1 mRNA in HL60 after transient transfection of siRNA 48 h(2-ΔΔCT)

2.3成功構建慢病毒干擾載體LV-ADRM1-shRNA載體：TGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGT TTTAAAATTATGTTTTAAATGGACTATCATATGCTTA CCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATA TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGGGTCTAC GTGCTGAAGTTCACTCGAGTGAACTTCAGCACGTAG ACCCTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGT GGATAACCGTATTACCGCCAGGCATTAGTTATTAAT AGTAATCAATTAGGGGGTCATTAGTTCATAGCCCAT ATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTAACGGAAAATG GCCCGCCTGGCTGATCGCCCAACGACCCCCGCTCAT TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGGAACGC CAATAGGCCCTTTCCATTGGGGTCAATGGGTGGAGT ATTTACGGGTAAACTGCC；LV-scrambled-shRNA載體：GGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTG TT CTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGC TTGGATTTCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACG AAGTTATAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAA CTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATAT CCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTTTCTCCGAACGTGT CACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTT TTTCTCGAGTACTAGGATCCACGCGAATTAATTCTG TGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCA GGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCA TCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCC AGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC ATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGC CCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA。

2.4成功構建ADRM1shRNA與scrambledshRNAHL60細胞由上海吉凱公司包裝慢病毒及滴度測定。慢病毒感染HL60細胞，MOI值為病毒滴度/接種細胞數。慢病毒感染有效率受MOI值、細胞狀態、細胞接種密度、營養狀態、培養條件、有無助轉劑及其濃度的影響。我們在優化HL60細胞感染條件后，采用不同 MOI值，GFP表達效率也不同，兩者之間不呈正比(Tab 2)；普遍認為GFP表達效率與慢病毒感染有效率呈正相關。

Tab 2 Effective rate of lentivirus infection in different MOI values

慢病毒對細胞也有一定的毒性作用，所以我們以MOI小于75的病毒量感染HL60細胞(Fig 3)，再采用流式細胞分選儀分選出GFP陽性細胞，即為慢病毒成功感染的HL60細胞。分選時分析觀察10 000個細胞，首先以側向光散射(side scatter，SSC)和前向光散射(forward scatter，FSC)設門。去除死細胞，圈選大小比較均一的活細胞群設門為P1；P1門內細胞以SSC和GFP再設門。以野生株HL60細胞(parental)為對照，其P1內細胞為GFP陰性，不分群，設門為P2(Fig 4B)。慢病毒感染的HL60細胞，P1內細胞分兩群(Fig 4D)，P2門外右為GFP陽性細胞，圈選該GFP陽性細胞群并設門為P3。P3內細胞即為慢病毒成功感染的HL60細胞。我們收集該P3細胞群。

Fig 3 Detection of lentivirus infection in HL60 cells(MOI=75,×100)

The photo on the left side is under the ordinary light microscope, while the right side under the fluorescence microscope. A, B: Scrambled shRNA;C,D:ADRM1 shRNA.

Fig 4 Sorting of GFP positive HL60 cells

A,B:Parental HL60 cells;C,D:HL60 cells infected with lentivirus carrying GFP fluorescence

2.5ADRM1shRNA、scrambledshRNA、parentalHL60細胞內ADRM1蛋白的表達Fig 5的Western blot結果顯示，ADRM1 shRNA組細胞內ADRM1蛋白表達明顯下調；scrambled shRNA和parental HL60細胞內ADRM1蛋白表達未見明顯差異。提示成功構建ADRM1干擾HL60細胞及其陰性對照株。

Fig 5 Expression of ADRM1 protein in ADRM1 shRNA, scrambled shRNA and parental HL60 cells

2.6ADRM1干擾前后HL60細胞增殖情況CCK-8法檢測parental、scrambled shRNA和 ADRM1 shRNA各組細胞增殖情況。如Fig 6所示，ADRM1 shRNA組細胞增殖緩慢，說明下調ADRM1抑制HL60細胞增殖。

2.7MG132對HL60細胞活力的影響CCK-8法檢測蛋白酶體抑制劑 MG132(0、0.1、0.25、0.5、0.8、1、1.5 μmol·L-1)作用24 h，對 parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA HL60細胞的影響。如Fig 7所示，MG132抑制parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA HL60 細胞活力，隨著MG132濃度提高各組細胞死亡增加；各組細胞在OD 450/630值相近(即0.15左右)，所需的MG132濃度分別為0.5 μmol·L-1(parental組)、0.8 μmol·L-1(scrambled shRNA組)和1.5 μmol·L-1(ADRM1 shRNA組)，說明ADRM1下調前HL60細胞對MG132敏感性較高，反映MG132對HL60細胞的毒性作用與HL60細胞內ADRM1蛋白水平相關。

Fig 6 Cell growth of parental, scrambled shRNA

Fig 7 Cell viability of parental, scrambled shRNA and ADRM1 shRNA groups treated with different MG132 concentrations for 24 h

2.8MG132對HL60細胞內ADRM1、UCH37蛋白表達的影響為探討蛋白酶體抑制劑 MG132抑制細胞增殖、降低其活力的作用與ADRM1的相關性，利用Western blot檢測 0.25、0.4 μmol·L-1MG132作用24 h后，parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA組細胞內ADRM1、UCH37蛋白表達變化。如Fig 8所示，0.4 μmol·L-1MG132作用24 h后，parental 和scrambled shRNA組細胞內ADRM1、UCH37蛋白表達減少；ADRM1 shRNA組ADRM1 蛋白表達提高，UCH37蛋白下調。0.25 μmol·L-1MG132作用下的parental HL60細胞UCH37 蛋白表達提高。0.4 μmol·L-1MG132作用后，ADRM1 shRNA組細胞ADRM1蛋白表達提高，0.25 μmol·L-1MG132作用下，parental組細胞UCH37蛋白表達提高，可能是各組細胞對低濃度MG132應激性反應，具體機制有待進一步研究。

2.9MG132促進HL60、NB4細胞凋亡細胞以1×105·L-1接種6孔板2 mL，設不同濃度 MG132實驗組，各組2個復孔，24 h后流式細胞術檢測各組細胞凋亡，獨立重復實驗2次。圖左上(upper left, UL)為死亡細胞，右上(upper right, UR)為晚期凋亡細胞，左下(lower left, LL)為活細胞，右下(lower right, LR)為早期凋亡細胞。如Fig 9、10所示，隨著MG132 濃度提高，細胞早期與晚期凋亡均增加。以MG132濃度為0.4 mol·L-1時HL60凋亡率為參照，當MG132濃度為0.8 μmol·L-1時HL60細胞早期凋亡變化較小，晚期凋亡大量增加；而MG132濃度為2 μmol·L-1時NB4細胞凋亡率，處于HL60細胞MG132濃度為0.25 μmol·L-1與0.4 μmol·L-1之間。以上結果說明NB4細胞對MG132敏感性小于HL60細胞，提示不同白血病亞型細胞株對 MG132藥物反應存在個體差異。

3 討論

ADRM1 mRNA在9株實驗室血液腫瘤細胞中過表達，這與前述研究ADRM1在多種腫瘤中過表達情況一致，說明ADRM1可能參與血液腫瘤，特別是AL的發生發展。

ADRM1干擾前后HL60細胞在0.5 μmol·L-1MG132作用下，parental組活力下調72%，scrambled shRNA組下調42%，而ADRM1 shRNA組下調30%，提示ADRM1表達高的腫瘤細胞對MG132敏感，受抑制明顯；隨著 MG132濃度提高，HL60細胞增殖緩慢、活力下降，此時各實驗組細胞內ADRM1、UCH37蛋白表達減少，說明MG132下調ADRM1、UCH37蛋白表達，抑制HL60細胞增殖與活力；HL60、NB4細胞隨MG132濃度提高凋亡亦明顯增加。以上研究為臨床治療AML采用抑制ADRM1表達手段提供了理論基礎。

*P<0.05vsparental 0 group;#P<0.05vsscrambled shRNA 0 group;ΔP<0.05vsADRM1 shRNA 0 group

特定基因的mRNA豐度不一定與其翻譯產物——蛋白質的表達量成線性關系，因為基因表達成蛋白的調控層次包括轉錄水平的調控、轉錄后調控、翻譯水平調控及翻譯后調控。此外，mRNA的降解、蛋白的降解、修飾折疊等因素都可能導致mRNA豐度與蛋白表達水平不一致。因此，可以出現ADRM1 mRNA水平較HL60高的NB4細胞凋亡所需MG132濃度較高的現象。

惡性腫瘤細胞具有自主生長、過度增殖、對抑制生長的調控信號不敏感、逃避細胞內在的凋亡信號、促血管生成、侵襲性生長及轉移的能力。惡性腫瘤的發生往往是單克隆腫瘤細胞增殖失控、凋亡受阻的結果。已有研究表明，ADRM1通過募集UCH37形成ADRM1/UCH37復合物，介導NF-κB的降解，并影響其活性，參與細胞周期和凋亡過程。這提示ADRM1在腫瘤中作用的發揮可能與UCH37及NF-κB信號通路有關。UCH37可通過影響Bax/Bcl-2比率和caspase-9、 caspase-3酶活性而抑制細胞凋亡。NF-κB與惡性腫瘤發生發展過程有著極為緊密的關系，對絕大多數惡性腫瘤具有促癌作用。靜息狀態的細胞，NF-κB位于胞質中，與IκB形成復合物。當該復合物被激活時，NF-κB暴露核定位位點，進入核內與特異性κB序列結合，啟動下游靶基因轉錄和表達。NF-κB主要調節炎癥和自身免疫反應，也可調控細胞周期及凋亡，影響細胞分化，可控制細胞增殖及癌變。研究表明，NF-κB轉錄因子可通過與Cydin D1的啟動子κB 位點結合而啟動該基因的轉錄，也可通過其他途徑間接上調Cyclin D1的表達。亦有研究顯示，NF-κB可通過激活Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E和c-myc的轉錄和表達，促進淋巴瘤細胞的細胞周期轉化和增殖。NF-κB通路的異常激活，可導致一系列細胞腫瘤相關基因的異常表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡、促進其增殖。因此，ADRM1可能通過UCH37改變Bax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制HL60細胞凋亡；也可能通過ADRM1/UCH37復合物影響NF-κB的降解或活性，促進細胞周期調控蛋白的表達，使細胞周期加速通過G0/G1期，促進細胞增殖，從而在白血病的發生發展中發揮作用。因此，本研究為臨床治療AML采用下調ADRM1表達策略提供了依據[4-6,8,14-15]。

Fig 9 Apoptosis of HL60 cells treated with different concentrations of MG132 for 24

A,B, C, D: Apoptosis of HL60 cells exposure to 0, 0.25, 0.4 and 0.8 μmol·L-1MG132 for 24 h; E:Early and late apoptotic rate of HL60 cells.*P<0.05vs0 group

Fig 10 Apoptosis of NB4 cells treated with different concentrations of MG132 for 24

A, B, C, D: Apoptosis of NB4 cells exposed to 0, 0.5, 1 and 2 μmol·L-1MG132 for 24 h; E:Early and late apoptotic rate of NB4 cells.*P<0.05vs0 group