外泌體的提取方法及其在藥物遞送系統中的應用

王飄飄，王會會，王 雷，姚 亮，彭代銀,2，陳衛東

(1. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230011；2．安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽 合肥 230031)

外泌體(exosomes，Exos)是細胞分泌的一種膜囊泡，因其可以將供體細胞的信息通過其攜帶的蛋白質、mRNA、miRNA等傳遞到受體細胞，實現細胞之間的信息交流及物質交換，并且可以作為藥物載體轉運藥物而引起科學家的廣泛關注[1](Fig 1)。外泌體作為內源性的天然藥物載體有著獨特的優勢，表面由脂質和蛋白質組成，使其可以穿透許多生物膜，提高藥物的運輸效率和靶向性，可以穩定存在于血液中，納米級尺寸明顯增強藥物在腫瘤部位的滲透滯留效應(permeability and retention effect, EPR)[2]。目前，許多抗癌藥物、基因藥物及抗炎藥物均被成功載入外泌體。但是由于沒有較好的外泌體分離純化和載藥的方法，使得其作為藥物載體的應用受到限制。本文主要回顧和討論外泌體作為藥物載體的研究進展及其面臨的挑戰。

1 外泌體簡介

外泌體來源于幾乎所有細胞的膜囊泡(直徑40～150 nm)，密度在1.13～1.19 kg·L-1之間 ，是目前臨床診斷和治療腫瘤等相關疾病的重要工具[3]。外泌體的形成先是細胞質膜的內陷形成胞內小泡，然后胞內小泡進一步發展成多泡小體，最后多泡小體與細胞質膜融合釋放[2]，其通常被釋放到細胞外，然后與其他的細胞質膜融合。外泌體是一個“納米球”，由來自于親本細胞的蛋白質和脂質組成，主要有熱休克蛋白(HSP70、HSP90)，膜轉運和融合蛋白(GTP酶、膜聯蛋白)，四分子交聯體家族(CD9、CD63、CD81)及多泡的生物合成(如Alix、TSG101)涉及的蛋白，外泌體膜表面豐富的蛋白使其可以與靶細胞膜上的特異性蛋白結合，使其具有靶向性[4]，如來自少突膠質細胞的外泌體，因帶有髓磷脂蛋白質，使其具有獨特的選擇屬性[5](Fig 2)。

Fig 1 Biogenesis of exosomes

Fig 2 Structure of exosomes

在藥物遞送系統的快速發展中，納米技術因能靶向和控釋使其具有很好的應用前景，各類型的納米載體能明顯提高藥物的治療效果[6]。病毒具有傳送其基因組進入其他細胞的能力而被應用于遞送遺傳物質到細胞[7]。然而，利用病毒轉染可能會引起潛在的基因突變，誘發癌癥與加重免疫反應，并且高額的成本限制了病毒載體在臨床上的應用[8]。

理想的載體應該是安全、有效，并且有最佳的生物利用度。同時，載體的穩定性，低的細胞毒性和免疫原性，以及能否成功地將藥物運送到特定的組織或細胞也是至關重要的。外泌體作為藥物遞送系統具有一系列的優點：(1)從患者的組織或血液收集(如骨髓、單核細胞或巨噬細胞)的外泌體，載藥后可以逃避單核吞噬細胞系統(mononuclear phagocyte system，MPS)的清除，從而減少藥物的清除率[9]。(2)外泌體具有潛在的靶向性，可以增加藥物輸送到靶組織的能力[10]。(3)外泌體膜的特定脂質體和蛋白質，使得外泌體可以直接與靶細胞膜融合，從而明顯提高藥物進入細胞的可能性。(4)外泌體載體可以避開內吞途徑的內化，而且外泌體的安全性在許多臨床試驗已經得到證實[11]。因此，越來越多的研究開始關注外泌體作為載體的可能性及臨床應用的價值。

2 外泌體的提取、分離方法

開發高效、快速、穩定，并且保持外泌體結構和生物功能完整性的方法，是目前外泌體應用于臨床的基礎和前提。從細胞上清和體液中提取分離外泌體的方法很多，但是外泌體的純度和產量卻和分離方法息息相關。通常分離步驟少、產率高，但是純度會受到影響。鑒于每種分離方法都有其優缺點，實驗可以根據樣本來源、下游實驗目的等，選擇合適的外泌體分離方法。2015年，國際囊泡組織(Internation Society for Extracelluar Vesicles , ISEV)指出，簡單依靠一種分離方法得到的外泌體的純度和產量都難滿足實驗的需求。因此，推薦聯合使用各種方法，從而得到高純度和高產量的外泌體。本文總結了常用的傳統和新興的外泌體提取方法(Fig 3)。

2.1超高速離心法

常用的是超高速離心法，該方法是被譽為分離外泌體的“金標準”。該方法利用離心力從細胞培養液或生物流體獲得外泌體，經過400×g、2 000×g、10 000×g的低速離心，除去細胞及大的細胞分泌物；最后超高速100 000×g離心得到外泌體[12]。超高速離心因操作簡單，不需要復雜的技術支持，并且成本相對較低而被廣泛使用。但是該方法耗時、產率低，得到的外泌體的數量和質量很大程度上受轉子的類型、轉子沉降角度等因素影響，其中最主要的問題就是差速離心法獲得的沉淀物是外泌體，但也會有其他的囊泡、蛋白質或蛋白和RNA的聚集體。

Fig 3 Isolation of exosomes

2.2尺寸排阻色譜法和超濾法尺寸排阻色譜法是利用分子篩理論，最初是根據蛋白質分子大小分離蛋白質的色譜技術。該方法的主要優點是不需要很大的離心力，從而保證了外泌體的完整性。Mol等[13]對比超高速離心和尺寸排阻色譜法得到的外泌體蛋白，結果顯示，后者得到的外泌體的蛋白豐度高于前者。這些基于過濾或尺寸排阻色譜的新方法為外泌體大規模的生產和臨床應用提供了可能。

超濾也是根據外泌體的尺寸將其分離出來的一種方法，超濾一般被認為是外泌體分離過程中的一個準備過程，通過超濾除去大分子和小分子的蛋白質。不過連續的超濾可以分離出外泌體，和超高速離心相比，超濾不需要特殊的設備就可以較短時間內分離出外泌體。但是，超濾膜對外泌體的黏附作用會降低外泌體的產量，并且超濾過程中施加的外力可能會使外泌體變形或者破裂。

2.3免疫親和層析法免疫親和層析法是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法，主要用于生物大分子的分離、純化。將其應用于外泌體的分離主要是借助外泌體表面的特異性抗體，如TSG101或四跨膜蛋白。此方法的原理是利用抗原抗體的特異性結合，只有囊泡表面有特異性的抗體才可以被識別，這使得提取的外泌體純度高，但是產量低。Zarovni等[14]分別用超速離心、密度梯度離心和免疫層析法，從血漿和細胞上清中提取外泌體蛋白，結果表明，免疫親和層析法得到的外泌體表面存在多種標記蛋白(Alix、CD9、CD63)，同時，ELISA和PCR結果也證明了該方法的可行性。

2.4梯度密度離心法研究發現，外泌體的密度在1.1～1.19 kg·L-1之間，因此，可以采用密度梯度離心法來分離外泌體。該方法是將超速離心結合蔗糖密度梯度或蔗糖墊結合，原理是先除去非囊泡物質，再通過梯度密度濃縮提取外泌體，該方法可以得到相對較為純凈的外泌體。傳統的梯度密度方法通常需要離心16 h，但是2012年，研究者[15]使用了62～90 h才分離出某些確切囊泡，因此，該方法可能不足以沉淀所有的外泌體。如果離心時間不充足，污染物質可能和外泌體保持在相同的密度層，特別是這個密度范圍又比較寬。

2.5聚合物沉淀法聚合物沉淀法用于分離病毒和其他的生物大分子已有50多年歷史，近幾年，將其作為一種新的方法來分離外泌體。目前，市場已經有應用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)溶液提取外泌體的試劑盒，最常見的是System Biosciences 公司的ExoQuick?和ExoQuick-TC?kits，該試劑盒操作簡單不需要特殊的儀器，但是價格昂貴。提取外泌體的試劑盒主要成分是PEG8000(30%～50%),將試劑盒與體液或細胞培養液4 ℃孵育過夜，之后再低速離心。

2.6微流控技術微流控是利用微納米級尺寸的管道來處理和操控流體所涉及的一門技術，其在外泌體分離方面的應用受到越來越多學者的關注。Jie等[16]課題組開發了一種三維納米結構微流控芯片，微柱陣列通過化學沉積將交叉多壁碳納米管功能化，然后其就可以識別特定的分子(CD63)并利用獨特拓撲納米材料高效的捕獲外泌體。Wunsch等[17]利用硅工藝生產納米級確定性側向位移(Nano-DLD)芯片，得到了均勻的間隙尺寸，該芯片可以靈敏地將20～110 nm 的顆粒分離。該研究證明了外泌體基于大小的位移，從而揭示了利用芯片分選和量化納米級生物膠體的潛力。

3 外泌體作為“貨物”載體

外泌體的脂質雙分子膜可以保護其在血液循環中不被降解，但是這種膜結構以及其內含各種豐富的物質，使得外泌體載“貨物”變得困難。外泌體只有保證膜結構的完整性，才能不引起免疫反應，不被MPS吞噬 。目前，將“貨物”載入外泌體的方法主要有兩種(Fig 4)：(1)前轉載，在分離外泌體之前，將“貨物”與母代細胞共培養和對母代細胞進行轉染，可以讓母代細胞分泌含有“貨物”的外泌體；(2)后轉載，分離出外泌體之后，將“貨物”載入外泌體。

Fig 4 Methods of drug loading

3.1前轉載前轉染主要是用轉染劑將“貨物”轉染進入親代細胞(或者將“貨物與親代細胞孵育”)，然后收集培養基，獲得載有“貨物”的外泌體的過程。該方法的主要問題是合適有效的轉染試劑很少，且轉染試劑無法完全去除，導致轉染效率低，無法排除轉染試劑對實驗的影響。

3.1.1外泌體載核酸類物質 Didiot等[18]將小干擾RNA通過疏水性修飾(hsiRNA)后，與外泌體孵育，結果載有靶向亨延頓mRNA的hsiRNA外泌體可以被小鼠原代皮層神經元內化，導致亨延頓mRNA和蛋白發生劑量依賴性沉默，然后單側注入含有hsiRNA的外泌體到小鼠紋狀體，導致寡核苷酸的雙側分布，亨延頓mRNA在兩側均有35%的沉默。遞送至腦的含hsiRNA外泌體廣泛分布和有效性有望改善和治療亨延頓以及其他神經變性疾病。Buscail等[19]利用工程化手段，將來源于正常成纖維細胞間充質細胞的外泌體修飾為“iExosomes”，其可以遞送小RNA，以特異性靶向突變體KRAS，導致疾病抑制，并增加小鼠模型的總體存活率。研究人員使用RNA干擾(RNAi)的靶向方法，用天然來源的外泌體遞送時，抑制胰腺癌細胞中的突變體KRAS的表達，從而影響多種胰腺癌模型中腫瘤的生長和存活。與正常的脂質體相比，工程化的外泌體(iExosomes)靶向致癌性KRAS，并且他們還發現，通過外泌體表面的CD47分子可以讓外泌體給巨噬細胞一個“別吃我”的信號，從而減少外泌體的損耗，提高其在血液中的半衰期，最終提高治療效果。

3.1.2外泌體載蛋白質 無論是化學試劑還是核酸，這些大分子物質都可以被成功載入外泌體中，但是載高分子質量的蛋白質卻存在很大難點，重組蛋白的提純耗時、耗錢，而且過程中因物理或者化學作用會導致蛋白變性。Yim等[20]最近研究一種新的蛋白質載入外泌體的方法：通過可逆蛋白相互作用，促進蛋白質載入外泌體(EXPLORs)，相比其他方法，該方法的載蛋白量更高。實驗過程中，在藍色熒光控制下，有效利用可逆蛋白與蛋白之間的相互作用，將貨物蛋白導入親代細胞，然后從親代細胞提取分離出含有目的蛋白的外泌體。因為EXPLORs是通過胞內蛋白活躍載入外泌體的，在這個過程中使用了藍色熒光，并且整個過程不包括蛋白提純的步驟。該課題組通過體內、體外實驗均成功地轉運諸如Cre recombinase一類的功能蛋白到靶細胞，他們進一步闡釋，認為EXPLORs技術對于提高治療性蛋白的裝載和轉運效率具有重要的意義。

3.1.3外泌體載化療藥物 Ascucci等[21]將紫杉醇(2 mg·L-1)和小鼠間充質干細胞(3×105)混合培養24 h，除去未進入細胞的紫杉醇，48 h以后收集細胞上清，超高速離心提取外泌體。高效液相色譜和紅外光譜結果顯示，間充質干細胞分泌的外泌體中含有紫杉醇，同時研究人員將含有紫杉醇的外泌體作用于人的胰腺癌細胞，結果顯示，含有紫杉醇的外泌體有效抑制了胰腺癌細胞的增殖。另外，該課題組還發現，不同來源的外泌體具有特異性的標記，且該標記有望成為疾病診斷的靶點。

3.2后轉載另一種常見的方法是將“貨物”與外泌體孵育，鑒于外泌體的磷脂雙分子層表面，該方法更適用于小分子的疏水性“貨物”。對于水溶性的“貨物”則常用電穿孔的方法將“貨物”載入外泌體。

3.2.1自然孵育 越來越多的研究聚焦于外泌體作為載體用于向中樞神經系統遞送藥物、RNA和蛋白質。為了克服血腦屏障(blood brain barrier, BBB)，外泌體需要靶向腦內皮的腦歸巢肽修飾，這可能會增強免疫應答。Yuan等[22]首次證明不需要這種修飾的外泌體也可以透過哺乳動物的BBB。原始巨噬細胞的外泌體一方面可以利用整合素淋巴細胞功能相關抗原1(lymphocyte function associated antigen-1, LFA-1)和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)，另外通過碳水化合物結合的C型凝集素受體，與包含BBB的腦微血管內皮細胞相關作用。更重要的是，炎癥中常見的ICAM-1上調可以促進BBB細胞對外泌體的攝取。研究者進一步的體內實驗證明，巨噬細胞的外泌體可以穿過BBB，并將大腦衍生的神經營養因子(neurotrophin, NT)遞送到腦中，這種傳播在腦炎癥的存在下會增強。

來自路易斯維爾大學的Agrawal等[23]探討了牛奶來源的外泌體作為口服遞送化療藥物紫杉醇(PAC)代替靜脈注射，從而改善藥物的負載效率和降低藥物毒性反應的可行性。研究結果表明，負載PAC外泌體(ExoPAC)的粒徑約為108 nm，負載率8%左右，-80 ℃時，外泌體和ExoPAC在模擬胃腸液中均表現出較好的穩定性。體外實驗發現，ExoPAC在PBS(pH 6.8)環境下，對PAC的緩釋效果可以持續至少48 h。體內實驗中，口服遞送ExoPAC作用于人肺癌荷瘤小鼠，其腫瘤的生長明顯受到抑制(抑制率為60%，P<0.001)。而同等劑量的PAC靜脈注射，只顯示出中等程度(抑制率為 31%)，且抑制作用無統計學差異。值得注意的是，與傳統靜脈注射相比，口服ExoPAC全身毒性和免疫原性毒性更低。

3.2.2電穿孔 電穿孔法因參數容易控制，多種“貨物”載入外泌體都可以使用該方法。Wang等[24]研究了胞外囊泡作為小RNA的靶向遞送系統，利用電穿孔法將siRNA/microRNA載入核酸適配體AS1411(AS1411是一種靶向腫瘤細胞高表達核仁素的核酸適配體)修飾的囊泡中，然后通過外泌體將siRNA/microRNA靶向遞送到乳腺癌組織。由于AS1411和核仁素的的結合達到瘤靶向(核仁素在乳腺癌細胞表面高表達)，這種靶向let-7miRNA的囊泡可在體外傳遞到人乳腺癌MDA-MB-231細胞。靜脈注射載有Cy5熒光標記的miRNA let-7的AS1411囊泡，可以選擇性靶向荷瘤小鼠中的腫瘤部位，并抑制腫瘤的生長，而且修飾的囊泡耐受性良好，沒有顯示明顯的非特異性副作用或免疫應答反應。

化療藥物雖然為腫瘤的治療帶來了希望，但是臨床使用的化療藥物均有不同程度的毒副作用，如阿霉素，其心臟毒性限制了阿霉素的廣泛使用。Hadla等[25]用電穿孔的方法將阿霉素載入外泌體中，構建一個新的藥物遞送體系，在后續的體內和體外實驗中均發現，與阿霉素相比，外泌體載阿霉素可以部分限制阿霉素穿過心血管內皮細胞，并減少阿霉素在心臟部位的聚集，從而降低了心臟毒性。外泌體載阿霉素在小鼠體內的耐受量明顯高于游離的阿霉素，從而增加了阿霉素對乳腺癌和卵巢癌的治療指數。

4 總結與展望

過去的幾十年中，越來越多的研究聚焦在外泌體作為藥物遞送系統的可能性，但是外泌體的提取方法、純度、產業化生產及低的載藥量等，限制了其進一步的發展。未來的研究將集中在如何提高外泌體的載藥量上，事實上，外泌體本就能夠攜帶大量“貨物”進入機體。外泌體的進一步修飾可以提高其活性，并且也可以根據疾病產生的細胞毒性(癌癥治療)，或保護特性(用于治療神經退行性疾病的影響，提高治療的效果)來修飾外泌體。新的治療干預措施，包括擴大生產規模和控制生產質量，嚴格的藥代動力學和毒理學研究，這些目標的實現將是后續的工業發展的關鍵步驟。目前，一些抗癌藥物包括阿霉素、紫杉醇和基因類藥物，都已經可以有效地負載到外泌體中，說明了外泌體在藥物遞送上的潛力。但是，外泌體的研究目前僅僅停留在實驗室基礎上，將其應用于臨床還需要很多的研究。