納米和微米一水草酸鈣對Vero細(xì)胞毒性的濃度效應(yīng)

饒晨穎 郭 達(dá) 孫新園 歐陽健明

(暨南大學(xué)生物礦化與結(jié)石病防治研究所，廣州 510632)

0 引 言

草酸鈣晶體是泌尿結(jié)石的主要成分之一[1-3]。研究表明，草酸鈣晶體能夠被腎小管上皮細(xì)胞粘附，沉積在腎小管腔和腎間質(zhì)中，引起腎組織的損傷和功能異常[4-6]。晶體與細(xì)胞的粘附作用可能是腎結(jié)石發(fā)生的早期進程[7-8]。

晶體對細(xì)胞性能的影響備受關(guān)注[9-11]。眾多報道表明，尺寸作為晶體的一項重要物理參數(shù)，在晶體與細(xì)胞間的相互作用時起到重要的作用。例如，Li等[12]對尺寸分別為 498、68、43和 19 nm的無定形SiO2顆粒對HepG2細(xì)胞毒性進行了研究。結(jié)果表明，尺寸越小的SiO2粒子其毒性作用越大，這種毒性作用引起了細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞收縮、染色質(zhì)縮合和空泡形成等。Hanna等[13]發(fā)現(xiàn)，與6 μm的CuO顆粒相比，42 nm的納米CuO顆粒具有更高的細(xì)胞毒性，后者通過破壞線粒體和損傷DNA，誘導(dǎo)了人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)的凋亡。Tamura等[14]研究了不同尺寸的微米級Ti與中性粒細(xì)胞 (Neutrophil)間相互作用的影響，相比于大尺寸的Ti顆粒(10、45、150 μm)，2 μm 的小尺寸 Ti對細(xì)胞的損傷最為嚴(yán)重，造成的生化指標(biāo)(如超氧化物陰離子、LDH、TNF-α以及IL-1β)的表達(dá)量明顯增加。而大尺寸的Ti顆粒對細(xì)胞損傷較小。Chithrani等[15]通過改變?nèi)芤旱倪^飽和度制得不同尺寸的金納米顆粒(14、50、74 nm)，并研究了尺寸的改變對Hela細(xì)胞內(nèi)吞動力學(xué)的影響，50 nm尺寸的金納米顆粒的內(nèi)吞量最大，并推測尺寸為50 nm的金納米顆粒為細(xì)胞的最優(yōu)內(nèi)吞的尺寸。

研究表明，與正常對照組相比較，腎結(jié)石患者尿液中存在的尿晶體在尺寸、濃度、晶相和形貌等方面均存在明顯差異[16-17]。尿微晶尺寸和濃度的不同會導(dǎo)致其在尿液中的聚集程度、對腎上皮細(xì)胞的損傷程度等產(chǎn)生差異，從而影響腎結(jié)石的形成。

基于此，在前面的工作中我們合成了5種不同尺寸(50 nm、200 nm、1 μm、3 μm、10 μm)的一水草酸鈣(COM)晶體，并比較研究了這些COM晶體對Vero細(xì)胞的損傷差異[18-19]。結(jié)果表明，COM的尺寸和聚集程度均是影響晶體細(xì)胞毒性的重要原因；細(xì)胞對晶體的內(nèi)吞方式與晶體尺寸密切相關(guān)[18]，Vero細(xì)胞內(nèi)吞50和100 nm的COM主要以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的途徑，而內(nèi)吞1 μm的COM主要以巨胞飲的形式內(nèi)吞，對于更大尺寸的微米晶體，Vero細(xì)胞很難內(nèi)吞。本文從濃度效應(yīng)的角度比較研究納米和微米COM晶體對腎上皮細(xì)胞部分亞細(xì)胞器的毒性差異，包括對細(xì)胞膜的損傷、線粒體膜電位下降、溶酶體完整性、細(xì)胞周期滯留和細(xì)胞凋亡等，期望從細(xì)胞和分子的水平上進一步闡述細(xì)胞損傷、晶體粘附與腎結(jié)石形成的機理，為臨床上抑制腎結(jié)石形成提供新的啟示。

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

材料：非洲綠猴腎上皮細(xì)胞株(Vero)(暨南大學(xué)生物制藥基地)；培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清(Hyclone，海克隆生物化學(xué)制品(北京)有限公司)，青霉素、鏈霉素(北京普博生物技術(shù)有限公司)；6、12和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(耐思生物科技(無錫)有限公司，中國)；細(xì)胞增生分析試劑盒 (Cell Counting Kit 8，CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所)，乳酸脫氫酶試劑盒(LDH，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，生物素化的透明質(zhì)酸(HA)結(jié)合蛋白 (bHABP，德國MERCK公司)；吖啶橙(acridine orange,AO),5,5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine iodide(JC-1)試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Annexin VFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；草酸、無水乙醇及其它化學(xué)試劑均為分析純。

儀器：傅里葉變換紅外吸收光譜儀(EQUINOX 55，BRUKER， 德國)；X 射線粉末衍射儀(D/MAX 2400，日本)；酶標(biāo)儀(safireZ，Tecan，瑞士)，流式細(xì)胞儀 (FACS Aria，美國BD公司)；熒光顯微鏡(Leica DMRA2，德國)；激光共聚焦顯微鏡(LSM510 META DUO SCAN，ZEISS，德國)；X-L 型環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM，Phillps)。

1.2 不同尺寸COM晶體的合成及表征

參照文獻[19]，通過改變反應(yīng)物的濃度、反應(yīng)溫度、溶劑和攪拌速度等參數(shù)，制得了尺寸分別約為100 nm和6 μm的COM晶體，XRD和FT-IR表明其為目標(biāo)產(chǎn)物。XRD的測試條件為：Cu Kα輻射(λ=0.154 nm)，40 kV，20 mA，掃描范圍 2θ=5°～55°。

含COM晶體的無血清培養(yǎng)液配制：先把稱好的晶體鋪平，紫外燈照射40 min除菌；然后現(xiàn)用現(xiàn)配，將納/微米COM晶體分別分散在一定體積的無血清培養(yǎng)液中，配制成濃度為50、100、200和400 μg·mL-1的懸浮液，超聲 5 min，備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

Vero細(xì)胞用含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)胎牛血清和1%(w/w)青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)CO2和飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2 d傳代一次，采用胰蛋白酶消化法對細(xì)胞進行傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，加入0.25%(w/w)胰酶-EDTA消化液1 mL，置37℃培養(yǎng)箱約3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察消化程度，消化適度后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 mL終止消化，充分吹打分散細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液。

1.4 細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞按濃度為 1.0×105mL-1，每孔 100 μL 接種于96孔培養(yǎng)板中孵育24 h。實驗?zāi)Ｐ头譃?組，每組重復(fù)3孔：(1)正常對照組：加入無血清培養(yǎng)液，不加任何試劑；(2)納/微米COM晶體處理組：加入濃度為 50、100、200 和 400 μg·mL-1的含納/微米COM晶體的無血清培養(yǎng)液，孵育6 h。達(dá)到作用時間后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，于37℃下孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度(A)，平行測定3個復(fù)孔，求A值的平均值。細(xì)胞活力(cell viability，CV)的計算式為：CV=Aexp/Acont×100%，其中Aexp為實驗組吸光度，Acont為對照組吸光度。

1.5 乳酸脫氫酶(LDH)釋放量檢測

細(xì)胞按濃度為 1.0×105mL-1，每孔 100 μL 接種于96孔培養(yǎng)板中孵育24 h。實驗分組同1.4。達(dá)到作用時間后，嚴(yán)格按照LDH試劑盒說明書進行操作，在490 nm處測定吸光度求得LDH釋放量。

1.6 透明質(zhì)酸(HA)表達(dá)檢測及HA熒光強度的定量分析

細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板中孵育24 h。實驗分組同1.4。到達(dá)作用時間后，吸除上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，接著用固定液(由 5%(w/w)冰醋酸、10%(V/V)福爾馬林和70%酒精(V/V)組成)固定細(xì)胞20 min，然后用PBS洗滌細(xì)胞 3次， 每次5 min， 再加入100 μL 5 μg·mL-1的bHABP溶液(配制在質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的牛血清白蛋白溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配)，4℃條件下孵育過夜；之后用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min；再加入100 μL FITC-avidin(異硫氰酸熒光素-親和素)孵育1 h后，用 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，加入 DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色液復(fù)染4 min，用PBS洗滌3次，每次5 min；最后用抗淬滅劑封片，置于共聚焦顯微鏡下觀察，細(xì)胞表面表達(dá)透明質(zhì)酸的地方為綠色，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色為藍(lán)色。

HA定量分析：HA的熒光強度根據(jù)儀器附帶的Axiovision軟件(ZEISS，德國)確定，每個樣品對100個細(xì)胞的HA進行定量檢測，取平均值。

1.7 溶酶體完整性檢測

細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔1 mL接種于12孔培養(yǎng)板。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃下孵育24 h后，實驗分組同1.4。吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍。 用DMEM 配制的5 μg·mL-1的AO染色15 min。然后用濃度為200 μg·mL-1的納/微米COM處理6 h。細(xì)胞用PBS清洗3遍，熒光顯微鏡下觀察AO在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。對于細(xì)胞的熒光定量檢測，細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，AO染液及晶體處理同上。處理時間達(dá)到后，酶標(biāo)儀下檢測紅色和綠色熒光強度。激發(fā)波長為485 nm，反射波長為530 nm(細(xì)胞質(zhì)中AO為綠色)和620 nm(溶酶體中AO為紅色)。 溶酶體完整性(lysosomal integrity，LI)的計算式為：LIcont=Ired/Igreen，LIexp=Ired/(Igreen·LIcont)， 其中 LIcont表示對照組溶酶體完整性，LIexp表示處理組溶酶體完整性；Ired為紅光強度，Igreen為綠光強度。

1.8 線粒體膜電位(Δψm)檢測

細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔2 mL接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞匯合成單層。實驗分組同1.4。到達(dá)作用時間后，胰酶消化收集細(xì)胞，離心(1 000 r·min-1)5 min，去除上清液，用PBS洗2次，Δψm的檢測按JC-1試劑盒進行。加入200 μL JC-1染液混勻，37℃避光孵育15 min后，通過流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.9 細(xì)胞凋亡和壞死率檢測

細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔2 mL接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞匯合成單層。實驗分組同1.4。到達(dá)作用時間后，胰酶消化收集細(xì)胞，用Annexin V-FITC/PI雙染料染色20 min，染色后的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進行分析。

1.10 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔2 mL接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞匯合成單層，改用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育12 h，使細(xì)胞同步化。實驗分組同1.4。到達(dá)作用時間后，胰酶消化收集細(xì)胞，離心(1 000 r·min-1)，去上清液，加1 mL 4℃的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心去除上清液，用300 μL的PBS重懸細(xì)胞，邊振蕩，邊緩慢將細(xì)胞懸液加入到700 μL預(yù)冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70%(V/V)，4℃避光固定過夜；然后離心 (2 000 r·min-1)10 min， 棄上清液；500 μL PBS 混勻重懸，離心(2 000 r·min-1)10 min，棄上清液，加 200 μL 配制好的碘化丙啶(propidium，PI)染液，37℃避光孵育15 min，過濾，上機。

1.11 細(xì)胞表面微晶的SEM觀察

細(xì)胞按濃度為1.0×105mL-1，每孔2 mL接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞匯合成單層。實驗分組同1.4。達(dá)到粘附時間后，吸除上清液，用PBS洗滌3次，以2.5%(V/V)的戊二醛于4℃固定24 h后，再用1%(w/w)OsO4固定，接著再用PBS洗滌3次，梯度乙醇(30%、50%、70%、90%和100%，均為體積分?jǐn)?shù))脫水，最后用乙酸異戊酯固定后，馬上CO2臨界干燥，噴金包被。樣品噴金后在SEM下觀察晶體粘附情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞活力變化

表1為納米和微米COM晶體的SEM圖像和XRD圖。可以看出，它們的尺寸分別約為100 nm和6 μm，為純相的 COM 晶體(PDF No.17-541)[20]。

圖1A為不同濃度的納米和微米COM晶體與正常Vero細(xì)胞作用6 h后的細(xì)胞活力變化。它們都對正常Vero存在毒性，使得細(xì)胞活力下降。與微米COM相比較，納米COM導(dǎo)致的細(xì)胞活力更低，說明納米COM對Vero細(xì)胞的毒性大于微米COM。隨著晶體濃度增加，細(xì)胞的活力進一步下降。表明納米和微米COM對Vero細(xì)胞的毒性存在濃度效應(yīng)。

2.2 乳酸脫氫酶(LDH)釋放量變化

細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損害或完全裂解會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶如LDH釋放外泄到培養(yǎng)液中[21-22]。因此，LDH釋放量可作為細(xì)胞膜完整性的標(biāo)志，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量從而判斷細(xì)胞受損的程度。

正常Vero與納米和微米COM晶體孵化6 h后的LDH釋放量如圖1B所示。不加晶體的正常細(xì)胞的LDH釋放量最小，為(6.35±0.22)%。與不同濃度的納米COM或微米COM作用后，LDH釋放量顯著增加，表明細(xì)胞膜明顯受損；且納米COM的損傷作用明顯大于微米COM。

表1 納米和微米COM晶體的基本性質(zhì)和主要參數(shù)比較Table 1 Comparison of basic properties and main parameters of nano/micro-sized COM crystals

圖1 納/微米COM粘附后Vero細(xì)胞活力(A)和LDH釋放量(B)的變化Fig.1 Cell viability(A)and LDH release(B)changes of Vero cells after adhesion with nano/micron-sized COM

隨著晶體濃度從 100 μg·mL-1增加到 400 μg·mL-1，LDH釋放量進一步增加，說明高濃度的COM晶體對細(xì)胞膜的損傷作用更大。

2.3 透明質(zhì)酸(HA)的表達(dá)

由圖2可知，Vero細(xì)胞與COM晶體孵化6 h后，無論微米COM還是納米COM，都能檢測到較強的綠色熒光，說明COM能促使Vero表達(dá)HA。隨著晶體濃度的增加，綠色熒光增強，說明HA的表達(dá)量逐漸增加，尤其是當(dāng)濃度為400 μg·mL-1時，綠色熒光最強。

圖2 納/微米COM粘附前后Vero細(xì)胞HA的表達(dá):(A)熒光觀察圖;(B)定量柱形圖Fig.2 HA expression of Vero cells before and after adhesion with nano/micron-sized COM crystals:(A)fluorescence observation;(B)quantitative histogram

在相同的晶體濃度時，粘附納米COM晶體的Vero細(xì)胞的綠色熒光比粘附微米COM晶體的強。說明納米COM對細(xì)胞的損傷更大。

2.4 溶酶體的完整性變化

吖啶橙(AO)可以透過細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進入溶酶體內(nèi)，并與其內(nèi)部的酸性水解酶結(jié)合而發(fā)紅色熒光；而AO在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)則發(fā)綠色熒光。正常細(xì)胞或者細(xì)胞早期凋亡時，溶酶體結(jié)構(gòu)基本保持完整，而壞死細(xì)胞破壞了溶酶體的完整結(jié)構(gòu)，橘紅色熒光較少。因此可以通過測定紅色熒光和綠色熒光的熒光強度比值判定溶酶體的完整性[23]。

納/微米COM晶體對Vero細(xì)胞溶酶體的損傷通過熒光顯微鏡分析以及酶標(biāo)儀定量檢測(圖3)。對照組細(xì)胞溶酶體(即橘紅色熒光)清晰可見，分布在細(xì)胞內(nèi)各個部位，且與細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出的綠色熒光疊加呈現(xiàn)出強烈的橘黃色熒光。但是COM晶體擾亂了AO在細(xì)胞內(nèi)的分布，使紅色熒光明顯減小，這表明細(xì)胞的溶酶體受到了破壞；尤其是高濃度的納米COM處理組，代表完整溶酶體的紅色熒光十分微弱，說明納米COM處理組細(xì)胞的溶酶體結(jié)構(gòu)受到了破壞，定量分析溶酶體的完整性，400 μg·mL-1納米COM處理組僅為(64.26±1.04)%(圖3B)。

相比納米COM，雖然微米COM也造成了細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，但微米COM對細(xì)胞溶酶體的影響相對較小。

圖3 納/微米COM粘附后Vero細(xì)胞溶酶體完整性的變化:(A)熒光觀察圖;(B)定量柱形圖Fig.3 Lysosomal integrity changes of Vero cells after adhesion with nano/micron-sized COM crystals:(A)fluorescence observation;(B)quantitative histogram

2.5 細(xì)胞線粒體膜電位變化

線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著樞紐作用，線粒體膜電位的下降，是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件[24]。研究表明，過量H2O2的毒性效應(yīng)是通過誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使線粒體膜流動性下降，改變細(xì)胞膜和線粒體膜的通透性，致使Ca2+大量流入細(xì)胞和線粒體，從而導(dǎo)致鈣超載，激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而觸發(fā)凋亡[25]。

圖4為采用JC-1染色法檢測的不同濃度的納米和微米COM晶體對Vero細(xì)胞線粒體膜電位的影響。結(jié)果表明這些晶體引起的Ired/Igreen比值下降表現(xiàn)出尺寸依賴性和濃度依賴性。隨著晶體濃度由100 μg·mL-1增加到 400 μg·mL-1，2 種晶體均導(dǎo)致Δψm不斷下降(圖 4B)，且納米 COM 引起的 Δψm降幅比微米晶體更為明顯。

圖4 納/微米COM粘附后Vero細(xì)胞線粒體膜電位(Δψm)的變化:(A)散點圖;(B)Ired/Igreen比值Fig.4 Mitochondrial membrane potential(Δψm)changes of Vero cells after adhesion with nano/micron-sized COM crystals:(A)scatter plots;(B)Ired/Igreen

2.6 細(xì)胞凋亡和壞死率的變化

采用Annexin V/PI雙染通過流式細(xì)胞分析儀定量分析了COM晶體對細(xì)胞凋亡和壞死的影響。Annexin V染色用于揭示磷脂酰絲氨酸的暴露(細(xì)胞凋亡)，而PI用于揭示細(xì)胞膜的完整性(壞死)[26-27]。如圖5所示，在相同濃度下，暴露在納米COM組的細(xì)胞死亡率(Q1+Q2+Q4)大于微米COM，且均隨著晶體濃度的增大而逐漸增大。

圖5 納/微米COM粘附后Vero細(xì)胞死亡率的變化:(A)散點圖;(B)定量結(jié)果圖Fig.5 Cell death rate changes of Vero cells after adhesion with nano/micron-sized COM crystals:(A)scatter plot;(B)quantitative result plot

2.7 COM晶體對細(xì)胞周期的影響

碘化丙啶(PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。PI和雙鏈DNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強度與DNA含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被PI染色后，可以用流式細(xì)胞儀測定，然后根據(jù)DNA的分布情況分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡[28]。為了研究納米和微米COM對細(xì)胞周期的影響，我們通過PI染色后利用流式細(xì)胞儀進行了分析(圖6A)[29]。可以看出，納米COM晶體導(dǎo)致的S期細(xì)胞數(shù)量比微米的多。如在濃度400 μg·mL-1時，納米和微米COM導(dǎo)致的S期的細(xì)胞數(shù)量分別為20.13%和19.40%。與此同時，G1期的細(xì)胞數(shù)量也隨著晶體尺寸的減小發(fā)生了不同程度的下降，即納米晶體引起了更多的細(xì)胞滯留在S期，并引起G1期細(xì)胞數(shù)量減少。

圖6 納/微米COM粘附后Vero細(xì)胞周期的變化:(A)細(xì)胞周期分布圖;(B)G1期、S期、G2/M細(xì)胞比率Fig.6 Cell cycle changes of Vero cells after adhesion with nano/micron-sized COM crystals:(A)representative images of cell cycle;(B)G1,S,and G2/M cell ratios

2.8 SEM觀察

為了更直觀地觀察納/微米COM晶體與Vero作用后細(xì)胞和晶體的微觀變化，通過SEM對納米、微米COM晶體粘附6 h后的細(xì)胞進行了表征 (圖7)。可以看到，納米COM處理組的細(xì)胞收縮變圓，晶體聚集在細(xì)胞的表面。而微米COM處理組細(xì)胞表面粘附的晶體個數(shù)較少，粘附晶體的區(qū)域發(fā)生凹陷，細(xì)胞膜破裂。

當(dāng)細(xì)胞被損傷之后，細(xì)胞的表面微結(jié)構(gòu)和極性會發(fā)生顯著改變，如帶負(fù)電荷的磷酯酰絲氨酸(PS)由細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)，并在頂端膜表面表達(dá)各種能夠吸引鈣離子和草酸鈣晶體的帶負(fù)電荷的物質(zhì)如透明質(zhì)酸(HA)、膠原蛋白和骨橋蛋白(OPN)等[30-32]，這些負(fù)電荷的物質(zhì)分布在細(xì)胞膜表面后，成為吸附Ca2+離子和帶正電荷的COM微晶的位點，從而促進草酸鈣晶體的成核、生長和黏附。

圖7 SEM觀察Vero細(xì)胞與納/微米COM的粘附：(A,B)100 nm-COM;(C,D)6 μm-COMFig.7 SEM observation of the adhesion of nano/micron-sized COM crystals to Vero cells:(A,B)100 nm-COM;(C,D)6 μm-COM

2.9 納微米草酸鈣晶體引起腎上皮細(xì)胞損傷差異的原因

草酸鈣晶體與腎細(xì)胞的作用與腎結(jié)石形成密切相關(guān)。晶體對細(xì)胞的損傷會促進晶體的粘附，而晶體的粘附又進一步加重對細(xì)胞的損傷[33-34]。本文結(jié)果顯示，納米、微米COM晶體都會對Vero細(xì)胞產(chǎn)生損傷，且呈現(xiàn)濃度依賴性。細(xì)胞損傷后，促進了HA的表達(dá)(圖2)，使晶體粘附量增多[35]。在相同晶體濃度下，納米COM晶體表現(xiàn)出比微米COM晶體更高的細(xì)胞毒性，且更容易粘附和聚集在細(xì)胞的表面。造成這種毒性差異的原因可能是：(1)晶體尺寸的差異。納米晶體一方面由于尺寸較小，容易被細(xì)胞內(nèi)化，進入細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[36-37]；另一方面，內(nèi)吞的晶體會被轉(zhuǎn)運到溶酶體內(nèi)，并被降解成草酸根離子和鈣離子，造成溶酶體內(nèi)離子強度的變化，滲透壓失衡，破壞溶酶體的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞的壞死[38-39]。而微米晶體因為晶體尺寸較大，更易于粘附在細(xì)胞表面，使細(xì)胞膜損傷，甚至破裂，LDH釋放量增加(圖1B)，進而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境遭到破壞，引起細(xì)胞死亡[40]。因此，雖然納米、微米草酸鈣晶體都會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，但它們引起的細(xì)胞損傷程度不同。(2)晶體比表面積的差異。納米COM晶體具有較大的比表面積(表1)，其表面會有更多暴露的原子或離子，例如Ca2+和Ox2-，因此晶體表面存在豐富的活性位點，與細(xì)胞間的相互作用要比微米COM更強，細(xì)胞毒性更大，粘附量更多(圖7)。(3)晶體表面電位的差異。表1中電位數(shù)據(jù)顯示，納米COM比微米COM更加不穩(wěn)定，因此，納米COM更容易聚集在細(xì)胞表面(圖7)。

3 結(jié) 論

尺寸為100 nm和6 μm的COM晶體均能降低細(xì)胞活力、增加LDH釋放量和HA表達(dá)量、破壞溶酶體完整性、降低線粒體膜電位、提高細(xì)胞死亡率、導(dǎo)致細(xì)胞周期滯留在S期，且都呈濃度依賴性。在晶體濃度相同時，納米COM的細(xì)胞毒性比微米COM強。對納米、微米COM晶體細(xì)胞毒性的比較，有助于進一步闡明草酸鈣結(jié)石的形成機理，并為其預(yù)防提供啟示。