易錯PCR技 術(shù)定向進化褐藻膠裂解酶Alg-2的分析

李 樹，張 偉，趙春梅

（1.山東大學（威海）海洋學院，山東 威海 264209；2.江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

近年來，隨著海洋科學研究和海洋資源開發(fā)的不斷深入，褐藻膠裂解酶作為一種重要的海洋生物資源開發(fā)用酶越來越引起人們的興趣與重視。利用褐藻膠裂解酶作用于褐藻膠獲得的褐藻寡糖（alginate oligosaccharides，AOS），因具有特殊的化學特性和生物特性，在農(nóng)業(yè)、食品、藥品、保健品、化妝品、冶金、化工等領(lǐng)域具有潛在、廣泛的應用價值，并且酶法制備AOS具有環(huán)保、清潔、條件溫和、效率高等優(yōu)點，其取代物理化學法制備AOS已成為必然[1-5]；巨量的海藻生物質(zhì)因不含陸生植物難以降解的木質(zhì)素，且纖維素含量較低，易于進行生物處理，在轉(zhuǎn)化乙醇方面已有報道[6-7]，相比于纖維質(zhì)原料制造乙醇具有顯著的優(yōu)越性，而褐藻膠裂解酶在這一領(lǐng)域中將發(fā)揮難以取代的基礎(chǔ)性作用；在海藻遺傳工程的研究中，由于褐藻多糖黏度極高，很難將DNA、單細胞、原生質(zhì)體和胞內(nèi)物質(zhì)分離，而褐藻膠裂解酶的應用則有效排除了這種障礙，因而其在藻類生理生化、遺傳學、分子生物學等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用，這些領(lǐng)域均屬當今生命科學研究的前沿和熱點[8]；除此以外，也有報道褐藻膠裂解酶在醫(yī)學上已經(jīng)作為藥品酶應用于臨床，治療由致病菌銅綠假單胞菌引起的肺炎[9]。所以，在當今開發(fā)海洋資源戰(zhàn)略的大背景下，對褐藻膠裂解酶的研究與應用，必將成為開發(fā)新功能性物質(zhì)、新材料、新能源的重要基礎(chǔ)。

迄今為止，國內(nèi)外學者對褐藻膠裂解酶的來源、分類、酶學性質(zhì)、酶的結(jié)構(gòu)、酶催化機理等方面作了大量的基礎(chǔ)研究[9-16]，已報道的裂解酶近200 種。從已有的報道看，雖然研究者采用的酶活力測定方法有多種，酶活力定義方式及單位也不一致，但明顯不容忽視的一個事實是，褐藻膠裂解酶存在發(fā)酵水平低、酶活力不高等問題。目前國際市場上只有美國Sigma公司商業(yè)化的褐藻膠裂解酶產(chǎn)品A1603，酶活力大于10 000 U/g，但價格昂貴，僅以試劑形式出售。盡管已有20多種裂解酶的基因得到克隆和測序，并構(gòu)建出多種重組裂解酶基因工程菌，其主要目的還是獲得單一酶組分，進而研究其酶學性質(zhì)和催化特性，即使經(jīng)過高密度發(fā)酵的調(diào)控優(yōu)化，其表達量還處于較低的水平，例如酶活力僅為117、196 U/mL（3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法）[17-18]；本課題組篩選到的海洋細菌Bacillus mesophilus sp. nov和Tamlana sp. S12，其發(fā)酵上清液褐藻膠裂解酶活力分別為46、126 U/mL（DNS法）[19]；中國海洋大學篩選到的菌株HZJ216發(fā)酵上清液酶活力為338 U/mL（紫外法）[20]。已有報道的這些褐藻膠裂解酶及其生產(chǎn)菌株，目前還未見到官方認可的工業(yè)化生產(chǎn)及應用。

目前，半理性設(shè)計的蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于基因的體外進化，在改善酶的催化特性方面產(chǎn)生重要作用，而易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）就是采用最多的一種定向進化技術(shù)。易錯PCR技術(shù)是指通過改變PCR條件，例如改變Mg2＋或者Mn2＋，使用低保真度的Taq酶等，在某種程度下使堿基隨機錯配而產(chǎn)生不同的突變體，然后構(gòu)建突變體文庫以便篩選出具有目的表型的突變株。一般情況下，經(jīng)過1輪易錯PCR很難篩選出具有優(yōu)良性狀的目的基因，往往將第1輪篩選獲得的有益突變基因作為下一輪易錯PCR擴增的模板，連續(xù)隨機的突變，最終篩選出所需的有益突變，該技術(shù)已經(jīng)在提升脂肪酶、木聚糖酶、谷氨酸脫羧酶、精氨酸脫亞胺酶等酶活力方面取得了成功，對研究酶三維結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵氨基酸位點也起到了重要的指導作用[21-22]。

本研究采用易錯PCR技術(shù)對海洋細菌Tamlana sp. S12中具有代表性的褐藻膠裂解酶組分Alg-2進行2 輪體外定向進化，通過96 孔板高通量篩選分別獲得褐藻膠裂解酶活力提高和降低的突變株，通過與母本進行堿基和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)與酶活力相關(guān)的氨基酸位點，不僅有助于深入理解褐藻膠裂解酶的催化機制，更為后續(xù)利用理性設(shè)計手段改造褐藻膠裂解酶提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海洋細菌Tamlana sp. S12為本實驗室保藏；褐藻膠裂解酶Alg-2（基因登錄號ABD808071）、質(zhì)粒Escherichia coli DH5α、Rosetta agami（DE3）、pET-30a（＋） 寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取和質(zhì)粒提取試劑盒 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 上海生工生物技術(shù)服務有限公司；PCR試劑盒 德國Qiagen公司；基因標準Marker 美國Thermo Scientific公司；牛血清蛋白、瓊脂糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6B瓊脂糖凝膠電泳儀、VC950型超聲波細胞破碎儀 美國Sonics公司；AB204-N分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；LC-15C高效液相色譜 日本島津公司；CMax Plus酶標儀 日本Hitachi公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE公司；UV-2100紫外-可見分光光度計 美國Unico公司。

1.3 方法

1.3.1 易錯PCR擴增

分別采用不同濃度的Mg2＋（5、6、7、8、9、10 mmol/L）和Mn2＋（0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mmol/L）對褐藻膠裂解酶Alg-2進行易錯PCR擴增，并通過兩者的不同濃度配比進行優(yōu)化。根據(jù)Alg-2的基因序列設(shè)計引物為F：5’-TACTCAGGATCCTCTACTGATG ATGATTTAGTTGA-3’；R：5’-TACTCAAAGCTTCTAT AACGTGGTATGCGATT-3’。

PCR體系為50 μL（Mg2＋和Mn2＋除外）：1×Taq DNA聚合酶緩沖液、0.2 mmol/L dATP、0.1 mmol/L dGTP、0.5 mmol/L dCTP和dTTP、引物30 pmol、模板 DNA 1 μg、Taq DNA聚合酶3 U。

PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性55 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min。

1.3.2 突變體文庫的構(gòu)建

易錯PCR的擴增產(chǎn)物電泳檢測合格后，試劑盒切膠回收。用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI分別對載體pMDTM18-T和易錯PCR條帶進行消化，將Alg-2基因與線性化載體片段連接，16 ℃過夜，將連接產(chǎn)物電擊法轉(zhuǎn)入擴增宿主E. coli DH5α中，涂布含硫酸卡那霉素（50 mg/L）的抗性平板構(gòu)建突變體文庫。

1.3.3 突變文庫的篩選

96 孔板中每孔裝有1 mL滅菌LB培養(yǎng)基，對應一株轉(zhuǎn)化子，并且將野生型Alg-2（親本）作為對照。30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，所得菌液即為粗酶液。利用排槍快速移取100 μL粗酶液至96 孔PCR板中，注意每孔一一對應，孔中事先加入底物溶液100 μL（1%褐藻酸鈉溶液），于45 ℃水浴30 min，再加入200 μL的DNS溶液100 ℃水浴5 min，顯色，利用酶標儀在540 nm波長處測定吸光度。發(fā)酵上清液的粗蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[11-12]。酶的比活力單位（U/g）定義為：每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需的蛋白量。以親本酶活力（2 675.2 U/g）為參考，將高于或者低于酶活力20%以上的轉(zhuǎn)化子視為突變體，進行斜面保藏。

1.3.4 褐藻膠裂解酶動力學Km值測定

Km值的測定采用雙倒數(shù)作圖法[23]。

1.3.5 褐藻膠裂解酶三維結(jié)構(gòu)模擬及突變位點分析

篩選獲得的突變體與親本進行基因測序后，根據(jù)堿基序列生成氨基酸序列，分析堿基及氨基酸的突變情況。在SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫（http://swissmodel.expasy.org/workspace）中輸入各氨基酸序列生成褐藻膠裂解酶Alg-2的三維結(jié)構(gòu)，分析其位點突變效應。

1.3.6 定點突變驗證

為驗證相關(guān)氨基酸的突變效應，選取酶活力正突變株P(guān)2-81，委托華大基因（北京）針對Lys286進行定點突變；選取酶活力負突變株N2-47，針對Gly60和Asp275進行定點突變。以重組質(zhì)粒E. coli DH5α為模板設(shè)計引物，F(xiàn)和R為基因上下游引物，F(xiàn)m和Rm為突變位點的上下游引物。以Lys286的定點突變?yōu)槔?，引物F同1.3.1節(jié)，F(xiàn)m：5’-GGATCCTTAATACTTCGAAGGACCTG-3’；Rm：5’-AGTGATCGGAGGTTAGTAAGCTAATG-3’；引物R同1.3.1節(jié)。其中下劃線部分為SalI的酶切位點，由CGAAGG突變成CGGAGG。分別以F/Rm和Fm/R為引物，擴增出含有突變位點的片段，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒并測序[6,24]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR電泳照片用Photoshop CS6處理，相關(guān)數(shù)據(jù)用軟件Origin 8.0作圖，基因堿基的突變位點采用DNAMAN 8.5進行對比，褐藻膠裂解酶的三維結(jié)構(gòu)采用SWISSMODEL模擬，其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Word 2010處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mn2＋和Mg2＋對易錯PCR的影響

易錯PCR是通過改變常規(guī)的PCR條件，在某種程度下使堿基隨機錯配而產(chǎn)生不同的突變體，而調(diào)整體系中的Mg2＋或者Mn2＋濃度則是目前常用的方法[25]。分別采用5、6、7、8、9、10 mmol/L Mg2＋對Alg-2進行PCR擴增，由圖1可知，隨著Mg2＋濃度的升高，PCR電泳條帶的亮度也逐漸增加，在Mg2＋濃度為9 mmol/L和10 mmol/L時結(jié)果較為理想。

圖1 Mg2＋濃度對易錯PCR結(jié)果的影響Fig. 1 Effect of Mg2+ concentration on error prone PCR

Mn2＋可以通過降低聚合酶對模板的特異性而增加堿基錯配概率。選取0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mmol/L不同濃度的Mn2＋進行易錯PCR，由圖2可知，所選范圍內(nèi)的Mn2＋濃度對PCR影響不大，電泳條帶的亮度均比較理想。

圖2 Mn2＋濃度對易錯PCR結(jié)果的影響Fig. 2 Effect of Mn2+ concentration on error prone PCR

選擇Mg2＋（9 mmol/L和10 mmol/L）和Mn2＋（0.05、0.1、0.15 mmol/L）的不同濃度組合，進行PCR構(gòu)建突變文庫，從每組突變文庫中隨機抽取5 株菌進行Alg-2的基因測序以計算突變率，如表1所示，其中梯度2（Mg2＋9 mmol/L、Mn2＋0.1 mmol/L）的平均突變率為0.27%，接近0.25%的范圍，即每個基因序列有4 個堿基突變，這是目前公認的合適突變率，而其他梯度的突變率均偏低或者偏高，棄用。

表1 不同濃度Mg2＋和Mn2＋組合的PCR突變率Table 1 PCR mutation rates with different concentrations of Mg2+ and Mn2+

2.2 突變文庫的篩選結(jié)果

以褐藻膠裂解酶Alg-2基因組為模板進行第1輪易錯PCR。將重組質(zhì)粒pMDTM18-T電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入擴增宿主E. coliDH5α中，篩選獲得突變文庫5 000 株菌。利用96 孔板發(fā)酵配合酶標儀測酶活力高通量篩選酶活力突變菌株。由表2可知，相比于母本Alg-2的酶比活力2 675.2 U/g，1株正向突變株P(guān)1-37（酶比活力4 332.5 U/g）和1株負向突變株N1-42（酶比活力1 417.4 U/g）被篩選獲得。分別以P1-37和N1-42的基因組為模板再進行第2輪易錯PCR，突變文庫容量仍然為5 000 株菌。經(jīng)過96 孔板發(fā)酵及酶活力測定，在以P1-37為模板的突變株中獲得1株酶活力進一步提高的菌株P(guān)2-81，褐藻膠裂解酶比活力達到6 420.8 U/g，是母本的2.41 倍；而在以N1-42為模板的突變株中獲得1株酶活力更低的菌株N2-47，其活力降低至294.2 U/g，只有母本的11.2%，上述結(jié)果證明易錯PCR技術(shù)在改進酶活力方面確實存在極大的優(yōu)勢。

表2 兩輪易錯PCR篩選結(jié)果Table 2 Results of two screening rounds with error-prone PCR

2.3 突變菌株的基因測序結(jié)果

對2輪易錯PCR篩選獲得的4 株褐藻膠裂解酶Alg-2基因突變株進行基因序列分析，結(jié)果表明，P1-37中有3 個堿基發(fā)生突變，并且堿基的變化均引起氨基酸的改變（表3）。在P1-37發(fā)生正向突變的基礎(chǔ)上進行第2輪易錯PCR，篩得的P2-81又有3 個堿基發(fā)生突變，除A486G外，其余2 個突變均引起氨基酸的改變。而對于負突變株N1-42，則有4 個堿基突變，其中T417A的突變編碼均為Arg，其余3 個都導致氨基酸的改變。在N1-42的基礎(chǔ)上再次進行易錯PCR，獲得的N2-47中又有2 個堿基發(fā)生突變，其中的T285A為無義突變。上述正突變和負突變的測序結(jié)果為解析Alg-2褐藻膠裂解酶活力的變化提供依據(jù)。

表3 易錯PCR突變菌株的基因測序結(jié)果Table 3 Gene sequencing of mutant strains with error-prone PCR

2.4 褐藻膠裂解酶的Km值

圖3 Alg-2母本及正負突變株的Km值測定Fig. 3 Km values of Alg-2 of parental strain and positive and negative mutants

如圖3所示，母本Alg-2的Km值為0.45 mmol/（min·mg），而酶活力提高的正突變株P(guān)2-81，其Km值下降為0.21 mmol/（min·mg），Km值下降表明褐藻膠裂解酶對底物的親合力提高，即酶的催化效率提高。而負突變株N2-47，其Km值上升至0.96 mmol/（min·mg），表明酶對底物的親和力下降，酶活力也相應地明顯下降。

2.5 褐藻膠裂解酶的突變位點分析與結(jié)構(gòu)模擬

將褐藻膠裂解酶Alg-2的親本和突變株的氨基酸序列通過SWISS-MODEL REPOSITORY進行三級結(jié)構(gòu)模擬。由圖4可知，Alg-2富含β片層結(jié)構(gòu)，屬于典型的PL7家族。由于酶的結(jié)構(gòu)具有較強的穩(wěn)定性，少數(shù)氨基酸的突變不會引起三維結(jié)構(gòu)的明顯改變，所以Alg-2的親本和突變株從三級結(jié)構(gòu)上基本一致，僅存在細微方面的差別。在正向突變株P(guān)1-37中，43位點的Gly轉(zhuǎn)變成Glu、188位點的Ile轉(zhuǎn)換成Thr、250位點的Ile轉(zhuǎn)換成Ser，這3 個位點均由極性較弱的氨基酸變成極性較強的氨基酸，親水性增強，其與褐藻多糖的結(jié)合力增強，因而是酶活力提高的重要原因[26]。在P1-37的基礎(chǔ)上獲得的P2-81，60位點的Gly被Asp取代，氨基酸的解離常數(shù)增大，同樣增加酶與底物的親和性[27]。275位點的Asp雖然被Tyr取代，酸性減弱，但是Tyr作為質(zhì)子的供體，是褐藻膠裂解酶完成β消除反應所必需的氨基酸[28]，這可能是P2-81酶活力進一步增強的原因。對于負向突變株N1-42，有4 個堿基發(fā)生突變，但引起3 個氨基酸的改變，為Leu74Phe/Lys221Asn/Tyr308Cys。在此基礎(chǔ)上進行第2輪易錯PCR獲得的N2-47，又有2 個堿基發(fā)生突變，但只引起了一個氨基酸的改變，為Lys286Glu。根據(jù)相關(guān)報道，褐藻膠裂解酶PL7家族中β片層結(jié)構(gòu)域中有3 個保守區(qū)域，而Lys在保守區(qū)域中發(fā)揮著重要的作用[29-30]。由此推測2 株負向突變株中Lys被替換是導致Alg-2酶活力急劇下降的重要原因。

圖4 褐藻膠裂解酶Alg-2三維結(jié)構(gòu)模擬Fig. 4 Three-dimensional structure simulation of Alg-2

2.6 定點突變驗證結(jié)果

為驗證上述部分氨基酸位點的突變效應，選取酶活力正突變株P(guān)2-81，委托華大基因（北京）針對Lys286進行定點突變；選取酶活力負突變株N2-47，針對Gly60和Asp275進行定點突變。以Lys286定點突變?yōu)槔?，利用F/Rm和Fm/R為引物擴增出含有突變位點的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒并由華大基因進行測序，由圖5可知，成功由CGAAGG突變成CGGAGG，即Lys突變成Glu。將重組質(zhì)粒pMDTM18-T電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入擴增宿主E. coli DH5α中構(gòu)建P2-81的突變株，發(fā)酵結(jié)果表明突變株的褐藻膠裂解酶的比活力為2 946.8 U/g，相比于母本下降幅度為54.1，這就進一步驗證上述假設(shè)，即保守區(qū)域中Lys的被替換是導致Alg-2酶活力急劇下降的重要原因。對于負突變株N2-47，針對Gly60的定點突變尚在條件優(yōu)化中，而對于Asp275的定點突變已經(jīng)取得成功，突變株中Asp突變成Tyr，發(fā)酵檢測其褐藻膠裂解酶的比活力由294.2 U/g提高到386.4 U/g，提高幅度為31.2%。這也進一步驗證上述假設(shè)，Tyr作為質(zhì)子的供體，是褐藻膠裂解酶完成β消除反應所必需的氨基酸[24]，從而使酶活力增強。本實驗室將繼續(xù)采用更多輪次的易錯PCR技術(shù)對褐藻膠裂解酶Alg-2進行定向進化并驗證更多位點氨基酸的突變效應。

圖5 菌株P(guān)2-81的Lys286定點突變測序?qū)Ρ菷ig. 5 Sequence comparison of site-directed mutations at Lys286 of mutant P2-81

3 結(jié) 論

本研究采用易錯PCR技術(shù)對海洋細菌Tamlana sp. S12中具有代表性的酶組分Alg-2進行體外定向進化。研究發(fā)現(xiàn)采用9 mmol/L Mg2＋、0.1 mmol/L Mn2＋的濃度組合可以使得易錯PCR的突變率保持在合適范圍。經(jīng)過2 輪易錯PCR及96 孔板發(fā)酵篩選，分別獲得2 株正突變和2 株負突變菌株，其酶活力分別是親本（2 675.2 U/g）的162%、241%、53%、11%。酶的動力學分析顯示，正突變株P(guān)2-81的Km值比親本降低50%，而負突變株N2-47的Km值比親本提高106%，表明突變株對底物的親和力有極大的上升和下降?；驕y序及氨基酸序列分析結(jié)果表明，Glu、Thr、Ser、Asp和Tyr對褐藻膠裂解酶活力提高起到正面的積極作用，而保守區(qū)域Lys的突變起到負面的消極作用。后續(xù)人工合成的定點突變則進一步對Asp和Lys的正/負調(diào)節(jié)作用進行證實。本研究中獲得的酶活力最高的突變株P(guān)2-81，其比活力為6 420.8 U/g，雖然和目前美國Sigma公司商業(yè)化的產(chǎn)品（比活力＞10 000 U/g）相比還有不小的差距，但本研究室將繼續(xù)采用更多輪次的易錯PCR技術(shù)對褐藻膠裂解酶Alg-2進行定向進化，進一步提高其酶活力。本研究有助于深入理解褐藻膠裂解酶的催化機制，為后續(xù)利用理性設(shè)計手段改造褐藻膠裂解酶提供理論參考。