白肋煙煙葉氮同化能力及其對硝酸鹽積累的影響

李亞飛，常棟，馮雨晴，楊惠娟，王景，王俊，史宏志

1 河南農業大學/國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州文化路95號 450002；

2 河南省煙草公司平頂山市公司，河南省平頂山市建設路西段263號 467002

白肋煙是一種典型的葉色黃綠突變的煙草類型，是由Yb基因突變引起的葉綠素缺乏表型，其煙葉色素含量僅為普通綠葉煙草的1/3左右[1]。白肋煙在混合型卷煙的葉組配方中約占30%，對調控其感官質量和吸食品質均具有重大貢獻[2]。白肋煙煙葉硝酸鹽明顯較其它煙草類型高，但其積累原因不明，對提高煙葉安全性十分不利。

在生產中，白肋煙施氮量較烤煙高3～5倍，但煙葉產量卻未有顯著差異[3-4]。白肋煙煙葉硝酸鹽含量高，氮效率和氮素利用率低，易造成環境問題和資源浪費[5]。Lewis等[6]研究指出白肋煙Yb基因突變與煙葉硝酸鹽和TSNA積累存在密切關系。硝酸鹽是煙葉TSNA形成的重要前體物[7-8]。Fischer等[9]研究認為煙葉硝酸鹽含量水平是TSNAs的一個重要指示物，硝酸鹽還原形成亞硝酸鹽過程可能是限制TSNAs積累的重要環節。因此，在現階段，降低煙葉硝酸鹽是降低TSNAs的有效方法。硝酸鹽同化作用受品種、施肥、光照、土壤條件等因素影響，與硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（GDH）等密切相關，其中NIA和GS1基因過表達能夠明顯提高氮同化作用和作物產量[10-14]。目前，關于煙葉硝酸鹽的研究，多集中在對TSNA形成的影響上，而針對其在白肋煙煙葉中的積累原因研究較少。

前期研究發現，通過比較白肋煙和烤煙煙葉轉錄組差異，兩者氮代謝差異主要集中在硝酸鹽還原同化相關基因表達上[15]。在此基礎上，對兩類型間煙葉色素含量、氮同化關鍵酶活性及相關基因表達情況、碳水化合物含量、硝酸鹽代謝過程產物和硝酸鹽積累等差異進行分析，尋找影響硝酸鹽同化利用的主要因素為今后進行品種改良和調控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和培養

選用品種，烤煙：紅花大金元（HD）和中煙100（Z100），白肋煙：TN90和TN86。試驗所用材料在國家煙草生理生化研究基地人工氣候室內培養。氣候室條件設置：溫度為22～28 ℃，每12 h晝夜交叉光照（白天時間段設置為7：00-19：00），光照800 μmol m-2s-1，濕度85 %。

煙草種子在2 %次氯酸鈉中消毒2次，每次5 min，隨后將其播種在填滿基質的200孔育苗盤中。待煙苗長至4～5片真葉（苗齡40 d左右）時，選取長勢均勻一致的壯苗，用去離子水將根系沖洗干凈后，將其移栽到小花盆中，1株/盆，用石英砂固定煙苗進行水培。

1.2 試驗設計

試驗設置6個處理：①4 mmol/L，HD；②4 mmol/L，Z100；③4 mmol/L，TN90；④4 mmol/L，TN86；⑤24 mmol/L，TN90；⑥24 mmol/L，TN86。在前期氮水平試驗（0，4，12，20，24，28，32，36 mmol/L中，確定了白肋煙和烤煙葉片生物量相同時的施氮水平，即白肋煙施氮量24 mmol/L時，與烤煙施氮量4 mmol/L時的葉片生物量相似。本試驗在此基礎上，分別在相同供氮條件和相同葉片生物量積累條件下，對白肋煙和烤煙煙苗碳氮代謝差異進行研究。營養液采用霍格蘭氏法配置，NO3-N：NH4-N = 3：1[15]。在營養液中通入空氣泵，以保持根系具有良好的通氣環境。待煙草種子萌發后，每2 d換一次營養液。

1.3 測定項目與內容

1.3.1 煙株干物質積累

試驗取樣和測定在移栽后10 d上午（10 ：00）進行。選擇長勢均勻一致的煙株，將各處理煙苗平均分成3份，分別用于新鮮樣本檢測、新鮮樣本保存（超低溫冰箱-80℃中保存）和殺青樣本保存。在樣本分組后，把各處理每份中煙苗的根、莖和葉分離，并用去離子水清潔干凈，待用吸水紙吸干后，進行測定和樣本保存。殺青樣本的制作方法：將各處理樣本根、莖和葉清潔干凈后，置入烘箱中105 ℃殺青20 min，60 ℃烘干至恒重，稱重，磨碎，過60目篩子后，保存。

1.3.2 煙葉硝酸還原酶活性（NRA）和谷氨酰胺合成酶活性（GSA）、色素和可溶性蛋白質含量測定

選取各處理煙苗最大功能葉6～8支脈之間葉肉，用剪刀將其剪成2 mm × 5 mm條狀，混勻后，應用D O'Neal等[16]方法測定煙葉GS活性，色素含量采用95 %乙醇提取法測定，NR活性采用活體法測定，可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定，具體方法均參照李合生[17]植物生理生化實驗指導說明書進行。

1.3.3 NH4-N、NO3-N、總氮、總糖和還原糖含量測定

煙葉NH4-N含量采用茚三酮比色法測定[18]。煙葉NO3-N含量采用濃H2SO4-水楊酸法測定[19]，煙葉總氮、總糖和還原糖含量按照國家煙草行業標準YC/T161，159-2002在流動分析儀上完成檢測[15]。

整株氮素積累量計算方法：

氮素積累量=（根總氮含量×根干重）+（莖總氮含量×莖干重）+（葉總氮含量×葉干重）

1.3.4 目標基因qRT-PCR測定

根據GenBank中nitrate reductase [NADH]1 [Nicotiana tabacum（common tobacco） ]（NIA1，Gene ID: 107823732）、nitrate reductase [NADH]2[Nicotiana tabacum（common tobacco） ]基因（NIA2，Gene ID: 107785409）序列、glutamate dehydrogenase A [Nicotiana attenuata]（GDHA_1，Gene ID:109225747）序列和glutamine synthetase-like [Nicotiana tomentosiformis]（GS1，Gene ID: 104119270）序列，分別設計特異性引物，具體如表1。按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈, 以cDNA 為模板, 按SYBR Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）說明書進行qRTPCR。反應體系含QuantiFast? SYBR? Green PCR Master Mix （2 ×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μM × ） 0.2 μL、PCR Reverse Primer（10 μM × ）0.2 μL、Nuclease-free H2O 0.4 μL、cDNA 模板1 μL。反應程序為，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，40個循環，每個處理3次重復，每個反應3次重復。根據擴增曲線確定每個基因的響應Ct 值，以L25為內參矯正PCR 模板的拷貝數，采用2–ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.4 數據分析

采用Excel2016和Origin pro 9.0軟件進行數據分析和制圖；使用SPSS 17.0軟件進行方差分析和相關性分析，以2種類型不同品種的平均值為兩個獨立樣本，用獨立樣本T檢驗法對煙株干物質積累量、色素、NRA、GSA、硝酸鹽、總氮等指標進行方差齊性檢驗和T檢驗，對煙葉硝酸鹽含量、硝酸鹽同化過程產物和干物質積累與氮代謝酶活性和碳水化合物含量間進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理煙株干物質積累比較

由圖1可知，在相同供氮條件下，白肋煙煙株根、莖、葉和整株干物質積累數量明顯低于烤煙品種，差異達極顯著水平，而白肋煙在增加5倍供氮量后，其煙株干物質積累與烤煙相近，未達到顯著差異，說明白肋煙氮效率和肥料利用率較烤煙低。

圖1 不同類型間煙株干物質積累的差異Fig.1 Differences of dry matter accumulation in different types tobacco leaf

2.2 不同處理煙葉色素含量比較

由圖2可知，在相同氮素供應（4 mmol/L）條件下，與烤煙相比，白肋煙煙葉葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和色素總含量相對較低，兩品種（TN90和TN86）平均值分別較烤煙（HD和Z100）低41.58 %、45.08 %、30.77 %和41.72 %，差異達極顯著水平，說明白肋煙煙葉葉綠素a、葉綠素b含量和色素總含量較低是該煙草類型的固有特性，可能對煙葉碳氮代謝造成不同程度的影響。在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉葉綠素a、葉綠素b含量和色素總含量與烤煙相似。

圖2 不同類型間煙葉色素含量差異Fig.2 Differences of pigment content in different types tobacco leaf

2.3 不同處理煙葉氮素還原同化關鍵酶活性和基因表達情況

由圖3和圖4可知，在相同施氮條件或相同葉片生物量積累條件下，白肋煙各品種煙葉硝酸還原酶活性/施氮量、谷氨酰胺合成酶活性/施氮量均較烤煙低，差異達極顯著水平，且白肋煙煙葉氮同化基因GDHA_1、GS1、NIA1和NIA2表達水平均較烤煙低；另外，增施氮肥，白肋煙煙葉NRA和GSA有升高趨勢，但增施氮肥后煙葉NRA仍低于烤煙，與基因NIA1和NIA2表達情況較為一致，說明NR可能是限制氮素還原同化的關鍵因素。在相同施氮量條件下，白肋煙各品種煙葉NRA和GSA均較烤煙低，差異達極顯著水平，且對應硝酸鹽還原同化基因（NIA1、NIA2和GS1）表達趨勢一致，說明白肋煙煙葉硝酸鹽還原同化能力相對較弱，是其煙葉硝酸鹽大量積累的一個重要原因；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙各品種煙葉NRA較烤煙低，GSA較烤煙高，差異達顯著或極顯著水平。

圖3 不同類型煙葉NRA和GSA差異Fig.3 Differences of NRA and GSA in different types tobacco leaf

圖4 煙葉氮代謝相關基因表達情況Fig.4 Expression of genes correlated with nitrogen metabolism in tobacco leaf

2.4 不同處理煙葉NH4-N和可溶性蛋白質含量比較

由圖5可知，不同處理各品種煙葉NH4-N含量/施氮量和可溶性蛋白質含量表現不同，其中在相同施氮條件和相同葉片生物量積累條件下，白肋煙各品種煙葉NH4-N含量/施氮量和可溶性蛋白質含量均明顯較烤煙低，差異達極顯著水平，這與白肋煙煙葉NRA和GSA較低表現一致，即白肋煙煙葉氮素還原同化能力相對較弱，對應氮素還原同化產物形成數量較少。

圖5 不同類型間煙葉NH4-N和可溶性蛋白質含量差異Fig.5 Differences of NH4-N and soluble protein content in different types tobacco leaf

2.5 不同處理煙葉總氮和氮素積累量比較

由圖6可知，相同施氮條件下，白肋煙煙葉總氮含量較烤煙高，差異達顯著水平，而根、莖和葉氮素積累量明顯均較烤煙低，白肋煙兩品種整株氮素積累量的平均值較烤煙低43.33 %，差異達極顯著水平，說明白肋煙煙葉總氮含量偏高不是由其氮素積累量引起的；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉總氮含量和氮素積累量均較烤煙高，差異達極顯著水平，說明白肋煙增施氮肥會加劇煙葉總氮含量偏高的現象。

圖6 不同類型間煙葉總氮和氮素積累量差異Fig.6 Differences of total nitrogen content and nitrogen accumulation in different types tobacco leaf

2.6 不同處理煙葉NO3-N含量和NO3-N/TN比較

由圖7可知，相同施氮條件下，白肋煙葉NO3-N含量平均值較烤煙高103.36 %，差異達顯著水平；結合白肋煙煙葉總氮含量和氮素積累情況可知，白肋煙煙葉硝酸鹽大量積累不是由于其氮素積累量所決定，可能與其氮素同化能力密切相關；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙兩品種煙葉NO3-N含量平均值較烤煙高875.09 %，差異達極顯著水平。在相同施氮條件或相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉NO3-N/TN均較烤煙高，呈現顯著或極顯著差異。由此說明，白肋煙整株和煙葉氮素積累量相對較低，但煙葉硝酸鹽含量普遍偏高，與其硝酸鹽未被還原同化利用密切相關。

圖7 不同處理煙葉NO3-N和NO3-N/TN差異比較Fig.7 Differences of NO3-N content and NO3-N content / total nitrogen content in different types tobacco leaf

2.7 不同處理煙葉總糖和還原糖含量比較

由圖8可知，在相同氮素條件下和相同葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉總糖和還原糖含量明顯較烤煙低，且差異均達極顯著水平。其中，在相同氮素供應條件下，白肋煙兩品種煙葉總糖和還原糖含量的平均值分別較烤煙低43.89 %和42.89 %；在相同葉片生物量積累條件下，白肋煙兩品種煙葉總糖和還原糖含量的平均值分別較烤煙低36.46 %和64.40 %。由此可知，白肋煙煙葉碳水化合物含量較低，可能會引起碳骨架和能源物質供應不足的現象。

圖8 不同類型煙葉總糖和還原糖含量差異Fig.8 Differences of total sugar and reducing soluble sugar content in different types tobacco leaf

2.8 相關性分析

在相同施氮條件下，白肋煙和烤煙煙葉總氮和NO3-N含量與煙葉NRA、GSA、總糖和還原糖含量均呈現負相關，其中NO3-N含量與煙葉NRA、GSA、總糖和還原糖含量的相關系數均達極顯著水平；煙葉NH4-N、可溶性蛋白質、葉干重和地上部分干重均與煙葉NRA、GSA、總糖和還原糖含量均呈現正相關，相關系數均達極顯著水平（見表2）。由此說明，煙葉硝酸鹽同化活動與氮代謝酶活性和糖類物質含量關系密切，即提高煙葉氮代謝酶活性和糖類物質供應有利于降低煙葉NO3-N含量。

表2 煙葉硝酸鹽同化過程物質與氮代謝酶活性和碳水化合物間相關性分析Tab.2 Correlation coefficients between nitrate assimilation products and activities of enzymes relative with nitrogen metabolism and carbohydrates in leaves

3 討論

白肋煙調制后煙葉硝酸鹽較烤煙高幾倍甚至幾十倍，對提高氮效率和降低TSNA形成十分不利[20,21]。在煙葉發育過程中，對白肋煙和烤煙煙葉硝酸鹽積累進行了研究，得出白肋煙煙葉硝酸鹽含量明顯較烤煙高，且類型間差異在苗期已存在[15,22]。在本試驗中，相同施氮條件下，白肋煙葉NO3-N含量較烤煙高103.36 %；白肋煙較烤煙增施5倍氮素后，其干物質積累與烤煙相近，但其硝酸鹽含量較烤煙高875.09%。在前期，對白肋煙和烤煙煙葉轉錄組進行分析，得出類型間差異主要集中在糖類物質合成和氮同化方面[15]；在此基礎上，本文通過分析白肋煙硝酸鹽同化過程產物及其影響因素，探索白肋煙硝酸鹽積累的生理原因。

硝酸鹽被植物吸收后，需被進一步還原和同化后才算是真正利用。NR是植物硝酸鹽代謝途徑上的限速酶，具有將硝酸鹽還原成為亞硝酸鹽的作用，其活性易隨施氮量增加而升高[23]。GS能夠將無機氮轉化成為有機氮，是氮素同化的關鍵酶[24]。一般情況下，硝酸鹽積累的本質原因是由硝酸鹽吸收作用大于其相對同化作用造成的[25]。Lu等[26]采用轉基因技術對氮同化途徑多個基因進行過表達，煙株35S:S523D-NR煙葉硝酸鹽和TSNA含量明顯下降，但缺乏氮同化酶活性對氮同化過程和硝酸鹽積累的影響研究。在相同氮素供應條件下，白肋煙煙葉NIA1、NIA2、GS1和GDHA_1等氮素還原同化相關基因的表達水平較烤煙低，且NRA和GSA均較烤煙低，尤其是白肋煙在增施5倍氮肥后，其煙葉NRA仍低于烤煙，說明白肋煙煙葉氮素還原同化作用相對較弱，且其NRA偏低可能與能源物質供應不足有關，這對促進硝酸鹽同化利用有負面影響。在相同氮素供應條件下，白肋煙煙葉氮素積累量明顯較烤煙低，但硝酸鹽含量較烤煙高。由此說明，白肋煙煙葉輸入的硝酸鹽未被充分還原同化引起其在葉中大量積累。因此，白肋煙煙葉氮素還原同化作用較弱，是其煙葉硝酸鹽積累的重要原因。

碳氮代謝是植物活體的基礎代謝，兩者密切相關。氮代謝活動為煙株碳代謝提供氨基酸、酶蛋白和光合色素，是優質煙葉形成的基礎[27,28]。白肋煙屬于黃綠葉色煙草，其煙葉色素含量低，煙葉總糖和還原糖等碳水化合物形成較少，對硝酸鹽還原同化作用有負面影響。在相關性分析中，煙葉硝酸鹽還原同化過程中NH4-N和可溶性蛋白質含量與煙葉總糖和還原糖含量均呈現正相關，相關系數達極顯著水平。韓錦峰等[29]研究指出，在煙葉發育過程中，碳氮比與NRA、蛋白酶活性、可溶性蛋白質和還原糖含量關系密切。因此，白肋煙煙葉色素含量低，碳骨架供應和能源物質形成較少，這可能是其硝酸鹽積累的根本原因。另外，有研究指出，硝酸鹽一旦積累就易出現難以再利用的現象[30]，可能會加劇硝酸鹽積累問題，這有待于進一步研究。

4 結論

在相同供氮條件下，白肋煙煙株干物質積累明顯較烤煙低，差異達極顯著水平；在白肋煙較烤煙增施5倍氮素后，兩類型間煙葉干物質積累相近。在相同供氮條件下，白肋煙煙葉氮素積累數量較低，但總氮和硝酸鹽含量較高，煙葉氮還原同化酶活性（NRA和GSA）和氮同化相關基因（NIA1、NIA2、GS1、GDHA_1）表達水平均較烤煙低，氮還原同化作用相對較弱，是引起白肋煙煙葉硝酸鹽積累的直接原因；白肋煙煙葉色素含量低、總糖和還原糖形成較少，為氮代謝活動提供碳骨架和能源物質不足，可能是白肋煙硝酸鹽積累的根本原因。