LC-MS/MS檢測動物源性食品中β-激動劑類是否需要酶解

辛堃 楊桂霞 李淑敏 葛明華

本實驗對β-激動劑是否需要酶解進行了實驗說明，結果表明克倫特羅和沙丁胺醇不需要酶解就能被提取出，而萊克多巴胺在不酶解時提取效率低。本實驗對酶解時間和酶解溫度進行了優化，在40℃下酶解2h時，三種瘦肉精的回收率和精密度均能滿足實驗要求，提高了檢驗效率。

瘦肉精是一類藥物的統稱，用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病，大劑量用在飼料中可以促進豬的增長，減少脂肪含量，提高瘦肉率，但食用含有瘦肉精的豬肉對人體有害，在我國已經禁用。瘦肉精是一種腎上腺類受體激動劑（神經興奮劑），即β-受體激動劑，如克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。“瘦肉精”化學性質穩定，加熱到172 ℃時才分解，因此，一般燒煮加熱方法不能將其破壞。如果長期食用含有瘦肉精的肉，會導致染色體畸變的可能，誘發惡性腫瘤，造成安全隱患。

β-受體激動劑大多有苯乙胺醇和叔丁基或異丙基連接而成的，一般可分為苯胺基、苯酚、淀粉三種類型，對于苯酚、淀粉苯環上那個羥基是結合的位點，β-受體激動劑在體內代謝完，會跟羥基結合，形成一個葡萄糖醛苷的代謝物，需要酶解游離出來，才能進行檢測。而不同的化合物，蛋白結合率也不相同。根據苯環上取代基的差異，克倫特羅屬于苯胺型結構軛合反應率和蛋白結合率低。但苯酚型的軛合代謝過程較強，如沙丁胺醇在組織和排泄物中主要以硫酸軛合物的形式存在，其次為葡萄糖醛酸軛化物；特布他林主要為硫酸軛化物；萊克多巴胺主要以葡萄糖醛酸軛化物形式存在。苯胺型結構的化合物在酸性環境下很容易由結合態轉變為游離態，所以有些標準對豬尿的檢測就沒有酶解這一步；萊克多巴胺苯酚型β-受體激動劑軛合代謝過程較強與蛋白結合率高，所以檢測時是需要酶解的。在肝臟組織中β-受體激動劑與蛋白結合率高、殘留量大，實驗時也需要酶解。

現行有效的β-受體激動劑類檢測標準主要有GB/T 21313- 2007、GB/T 22286- 2008、SN/T 1924- 2011和農業部1025號公告- 18-2008，四種方法均采用37℃下避光酶解16 h的方式把與蛋白結合的目標化合物釋放出來。考慮到實驗長，是否可以不進行酶解或者縮短酶解時間來提升實驗室檢測效率呢？本文通過實驗進行了論證，如下。

實驗部分

依據檢測方法在加標濃度為1ng/mL、2ng/ mL、5ng/mL時、回收率為85.0%～110.0%，相對標準偏差小于5%。標曲在濃度范圍0.5～10μg/kg 時線性關系良好（2 r> 0.995）。

主要儀器：Agilent 液相色譜 - 質譜聯用儀（1260- 6460）；高速動能均質儀（IKA：T25）；離心機（sigma：3- 18KS）；氮吹儀（Organomation：N- EVAP 112）；恒溫水浴搖床（上海博訊：HHS- 21- 8）；渦旋混合器（上海精科：XW- 80A）；電子天平（賽多利斯：BSA224S）；pH計（賽多利斯：PB-10）。

標準品及標準曲線配制：萊克多巴胺鹽酸鹽；氘代萊克多巴胺（d6）；鹽酸克倫特羅；克倫特羅- D9；沙丁胺醇；沙丁胺醇- D3，均使用德國Dr.Ehrenstorfer標準品。用甲醇溶解各標準品并稀釋成20 ng/mL的外標混合工作液和100 ng/mL內標混合工作液。用初始流動相配制成0.5、1、2、5、10 ng/mL的標準工作曲線。

樣品前處理：取三種有代表性可食部分肌肉組織陽性樣品（非加標）500 g，用組織搗碎機充分搗碎均勻，每個陽性樣品稱取3個平行樣進行酶解與不酶解的比對試驗，A為沙丁胺醇陽性樣品，B為克倫特羅陽性樣品，C為萊克多巴胺陽性樣品。稱樣2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入50 μL 100 ng/mL內標混合工作液，40 μLβ-葡萄糖酫苷酶，再加入20 mL 2.0 mol/L乙酸銨緩沖液（乙酸調節PH為5.2），渦旋1分鐘后放入37℃水浴震蕩器中避光過夜酶解16小時。取出離心管放置室溫，于9000轉高速離心，取上清液于另一50 mL離心管中，加入20 mL乙腈飽和的正己烷脫脂，渦旋振蕩10 min，于9000轉高速離心，取下清液過濾紙至另一離心管中，2 mL乙酸銨緩沖液洗滌濾紙，待凈化。凈化過程：使用混合陽離子交換固相萃取柱（Cleanert PCX 60 mg/3 mL），依次用3 mL甲醇，3 mL水，3 mL 0.1% Hcl進行活化，加載過樣，再依次加入3 mL0.1% Hcl，3 mL水，3 mL 50%甲醇水溶液進行淋洗。洗脫：將凈化柱放置10 mL離心管上，加入5 mL（95：5）的甲醇-氨水，50℃下氮氣吹干，用1mL 0.1%甲酸溶液溶解殘渣，注射器吸取后過0.22 μm水系膜于進樣瓶中，待檢測。

儀器條件。液相條件：色譜柱：Poroshell 120 EC- C18 3.0×50 mm 2.7- Micron流動相A（0.1%甲酸水）B（乙腈）；梯度條件：0- 1 min A 90%- 60%；1- 3 min A 60%- 5%；3- 5 min A 5%- 5%；5- 7 min 5%- 90%。離子源為電噴霧離子源；正離子模式下多重反應檢測；毛細管電壓：4000 V；離子源溫度：350 ℃；脫溶劑氣壓力：40 psi；脫溶劑氣流量11 L/ min。MRM 分析參數見表1。

檢測結果及分析討論：通過試驗得出克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺在0.5- 10μg/ L的范圍內線性關系良好，R2均大于0.998以上。見表2。

提取三種化合物的質譜圖發現三種標準物質無論在響應值、分離度和準確度方面都已經達到適合檢驗的條件，檢驗結果比較滿意，提取前后某一段的MRM 圖，按照信噪比S/N三倍確定最低檢出限來看，本方法檢出限可以達到0.1μg/L。圖譜見圖1：

實驗對沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺在37℃下酶解16h的檢測結果與不酶解時的檢測結果和結果偏差做出了匯總，見表3。

根據不酶解測得的檢測數據可以看出三種瘦肉精不酶解也是有一定提取效果的，克倫特羅和沙丁胺醇酶解與不酶解差別比較小，其結果相對偏差沙丁胺醇為9.3%、克倫特羅為6.9%，而萊克多巴胺酶解與不酶解的偏差為77.2%；如果我們認為37℃酶解16 h三種瘦肉精的提取率為100%的話，那么不酶解時沙丁胺醇提取率為91.1%；克倫特羅提取率為93.3%；萊克多巴胺提取率為44.3%。

由表3檢測結果得出結論，不酶解時，肌肉組織樣品中的克倫特羅和沙丁胺醇在2mol/L乙酸銨溶液中（乙酸調節PH為5.2）有90%左右被提取出，而萊克多巴胺只有40%左右被轉化成了游離態被提取到，還有60%左右以結合態留存在肌肉組織中。也就是說，實驗室可以省掉酶解過程直接對克倫特羅和沙丁胺醇這兩種化合物進行初篩，而萊克多巴胺在不酶解的情況下提取率不理想。

近年來市場推出的QuEChERS 多獸殘提取包產品，其檢測范圍中也有β-受體激動劑類化合物和對應的回收率，本實驗分別用陰性樣品加標回收和非加標陽性樣品A、B、C按QuEChERS方法作業指導書進行實驗比對，結果得出陰性加標樣品回收率在75- 90%之間，而非加標陽性樣品與酶解16 h結果比對，回收率在40- 70%之間。又因為提取液未經固相萃取柱濃縮凈化，并且提取液大多為純機溶劑，造成上機后噪音高、峰型變寬、平行樣之間的離子豐度比穩定性差等一些問題，檢驗精密度較低。

不酶解時，肌肉組織樣品中的克倫特羅和沙丁胺醇在2 mol/L乙酸銨溶液中（乙酸調節PH為5.2）有90%左右被提取出，實驗室可以省掉酶解過程直接對克倫特羅和沙丁胺醇這兩種化合物進行初篩，而萊克多巴胺在不酶解的情況下提取率不理想。

本實驗優化了酶解溫度和酶解時間，當在40℃下避光水浴酶解2 h時，通過實驗測得三種瘦肉精的回收率、提取率、和精密度均能滿足實驗要求，縮短了實驗室前處理時間，提高了檢測效率。