蛋白酶在洗衣液中的穩定性改良

吳美娜 ，李 磊 ，夏詠梅 ，劉 湘 ，王海軍

（1. 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122）

蛋白酶是洗滌劑工業中應用最廣泛的酶制劑，但在洗衣液中的穩定性遠遠低于其在洗衣粉中的穩定性。目前使蛋白酶在洗滌劑中保持一定穩定性的途徑有：改造生產蛋白酶菌株的基因[1]、將蛋白酶固定化[2，3]以及添加穩定劑[4-6]。相對于酶的改性及酶包覆技術的復雜性和較高成本，加入穩定劑以保持酶活的方法較為簡便并應用廣泛，但穩定性能好的穩定劑或復配穩定劑都不容易獲得。常用的穩定劑有二羧酸鹽、多元醇、多元酸以及一些無機鹽類，另外洗滌劑中的活性成分如一些非離子表面活性劑也對蛋白酶的穩定性具有一定的影響。目前普遍采用的穩定劑種類相對較少，硼酸鹽類穩定劑如硼砂的效果較好，基本能滿足室溫下加酶洗衣液的酶活保持要求，但硼砂已被歐洲禁止在加酶洗滌劑中使用[7，8]。因此，廣泛和深入地研究穩定劑、表面活性劑和環境因素對酶活的影響，并且給出切實有效的解決方案有著重要的實際意義。基于此，本實驗篩選對蛋白酶酶活可能有穩定效果的系列化合物如與硼砂結構類似的檸檬酸鹽，選用一款通用洗衣液配方，探討pH、溫度、洗滌劑中主表面活性劑、穩定劑種類及其用量等因素對酶活的影響，以期篩選出對酶活穩定性好的化合物或組合，為蛋白酶在洗衣液中的酶活保持以及加酶洗衣液的配方設計提供參考。

1 實驗部分

1. 1 主要試劑與儀器

檸檬酸銨（AR）、甘油（AR）、十水合四硼酸鈉（AR）、EDTA-2Na （AR）、無水氯化鈣（AR）、吐溫系列（AR）、司班20 （AR）、干酪素（CP）、山梨醇（BR）和福林試劑（BR），國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸鎂（w=99%），湖北如天生物工程有限公司；檸檬酸（食品級），河北百味生物科技有限公司；檸檬酸單甘酯（食品級），南京綠意生物科技有限公司；APG0810，APG1214，上海發凱化工有限公司；檸檬酸鈣（食品級）、AEO7（有機物含量為99%）、AEO9（有機物含量為99%）、AES （有機物含量為70%），山東優索化工科技有限公司。洗衣液配方（各組分以干基計，w）：AES，21.5%；AEO7，2.5%；AEO9，2.5%；檸檬酸三鈉，3.5%；聚醚消泡劑，0.05%；檸檬酸，0.1%；NaCl，0.5%；熒光增白劑，0.14%；開松，0.05%；檸檬香精，0.1%；余量為去離子水。實驗用水為去離子水。

DKB-501A型超級恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZHWY-103B型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；T6新世紀紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 Folin法測定蛋白酶酶活

將1%的酪蛋白溶液1 mL置于試管中，于40 ℃恒溫水浴中恒溫15 min，加入1 mL稀釋一定倍數的酶液。反應15 min后，加入2 mL三氯乙酸（0.4 mol/L）終止反應。繼續放置于水浴中恒溫15 min，過濾。移取濾液1 mL，加入5 mL碳酸鈉溶液（0.4 mol/L）和稀釋好的福林試劑1 mL，搖勻后繼續置于40 ℃恒溫水浴中20 min，恢復至室溫后用紫外分光光度計測定波長660 nm處的吸光度。在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶酶活單位。酶活單位為U/mL。

式中，A，由樣品測得的吸光度，與標準曲線比對可得到相應的酪氨酸質量（μg）；4，從4 mL反應液中取出1 mL溶液測定；t，反應時間，min；N，酶稀釋倍數。

除誤差線明確標示的以外，所有數據的相對誤差均小于5%。

1. 2. 2 酶活保持率的測定

依次加入蛋白酶和穩定劑于20 mL樣品瓶中，用渦流振蕩器將其混勻；之后再加入液體洗滌劑，使得溶液總質量為10 g；酶的最終質量分數為0.5%。攪拌混勻，并將此溶液置于恒溫裝置中保存，于不同時間取樣，一式兩份，稀釋后采用Folin法測定此時體系中蛋白酶酶活。實驗時間下體系中蛋白酶酶活與初始體系中蛋白酶酶活的百分比即為酶活保持率。

2 結果與討論

2. 1 穩定劑的篩選

硼砂曾經被作為物美價廉的蛋白酶穩定劑使用，直至歐盟禁用。本實驗以硼砂作為參照，選用與硼砂結構相近的檸檬酸鹽、多元醇、多元醇類非離子表面活性劑等16種穩定劑考察它們對3種蛋白酶在洗衣液體系中的穩定作用（圖1）。其中，穩定劑與所加酶的質量比 分別為：m（檸檬酸鎂）∶m（酶）=1∶10，m（檸檬酸鈣）∶ m（酶）=1∶4 000，m（其他穩定劑）∶m（酶）=1∶1。在40 ℃下保存加酶洗滌劑24 h后，檸檬酸鹽尤其是檸檬酸銨鈣（用檸檬酸銨和檸檬酸鈣按質量比20∶1混合而得）的穩定效果最好。檸檬酸銨鈣使得Purafect 4 000 L、EFFECTENZ P150和Purafect Prime 4 000 L的24 h酶活保持率分別比硼砂提高了19.75%，66.09%和37.91%。

圖 1 40 ℃下穩定劑對蛋白酶酶活性的影響Fig. 1 Effect of stabilizers on the proteases activity at 40 ℃

檸檬酸銨鈣和檸檬酸鈣對蛋白酶酶活保持率具有顯著的促進作用，可能是由于鈣離子作為酶的輔基能夠與酶的活性中心結合，使蛋白酶活性中的疏水結構向蛋白酶內部轉移，讓酶分子結構變得更為緊密而利于蛋白酶酶活的提高[9]。多元醇系列也對蛋白酶酶活有一定穩定作用，可能是由于多元醇系列物質能結合酶蛋白周圍的自由水，降低水活度，從而對酶活保持率起到正協同效應。而非離子表面活性劑吐溫系列和APG系列及司班20對3種蛋白酶活的保持存在一定差異，且均劣于硼砂優于空白。APG系列作為有一定去污能力的非離子表面活性劑，也可用于洗衣液中。因此以下將APG系列與檸檬酸銨鈣復合使用，考察檸檬酸銨鈣-APG0810-APG1214作為三元復合穩定劑體系對蛋白酶在洗衣液中的穩定作用。

2. 2 復合穩定劑對蛋白酶在洗衣液中的穩定作用

Purafect 4000L和EFFECTENZ P150這2種蛋白酶的基礎性質比較接近，故選擇其中一種進行進一步的研究。考察檸檬酸銨鈣-APG0810-APG1214作為三元復合穩定劑體系對蛋白酶Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L在洗衣液中穩定的影響。

選取L9（34）正交表，以蛋白酶酶活為指標，4個因素分別為檸檬酸銨鈣含量、APG0810含量、APG1214含量和蛋白酶含量，以確定三元復合穩定劑的最佳參數條件，正交試驗的因素和水平見表1，不同時間點下正交試驗的結果見表2和3。

表 1 正交試驗的因素和水平Tab. 1 Factors and levels for the orthogonal test

表 2 Purafect 4000L酶活穩定性正交試驗結果（40 ℃）*Tab. 2 Or thogonal test results of activity stability of Purafect 4000L （40 ℃）*

由表2和3可知，復合穩定劑對Purafect 4000L的96 h酶活保持率均優于硼砂和檸檬酸銨鈣。復合穩定劑對Purafect Prime 4000L的96 h酶活保持率均劣于檸檬酸銨鈣，但實驗號為5和9的復合穩定劑的7 d酶活保持率與檸檬酸銨鈣的幾乎一致。考慮到APG的屬性和可以減少檸檬酸銨鈣的使用，復合體系應該是個較好的選擇。通過對各個時間點下正交試驗的極差分析可知，2種酶的96 h酶活保持率的影響因素大小順序均為：加酶量＞ APG1214含量＞APG0810含量＞檸檬酸銨鈣含量。一周酶活保持率的最優組合分別為：2%檸檬酸銨鈣，1% APG0810，2% APG1214和0.5% Purafect 4000L；以及2%檸檬酸銨鈣，0.5% APG0810，0.5% APG1214和0.5% Purafect Prime 4000L。此外，40 ℃下實驗號為5和9的實驗組存放4周后，Purafect 4000L酶活仍保持約42%。

當加酶量為0.5%（最終質量分數）時，Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L在檸檬酸銨鈣-APG0810-APG1214復合穩定劑體系中的最佳組合分別為（以下均為質量分數）：2%檸檬酸銨鈣，1% APG0810和2% APG1214；2%檸檬酸銨鈣，0.5% APG0810和0.5% APG1214。將用上述2個復合穩定劑穩定的洗衣液分別放置于不同pH值和溫度下保存，以硼砂作為陽性對照，實驗結果如表4所示。

結果表明，所用復合穩定劑大幅提高了Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的pH和熱穩定性，尤其是在37 ℃下的pH穩定性。在pH=7，25 ℃下，Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的復合穩定劑體系的3周酶活保持率分別可達到84.3%和71.5%；而在pH=8，37 ℃下的3周酶活保持率分別為47.2%和30.4%，相應地，37 ℃下硼砂體系的3周酶活保持率分別為2.87%和13.5%。與表2中相應數據對比表明，即便在硼砂的穩定下，這2種酶在40 ℃時的洗衣液中的穩定性也會急劇下降。此外，實驗條件下，37 ℃下Purafect 4000L在所測試的洗衣液中的穩定性在pH=7～8內對pH不敏感；37 ℃下，復合穩定劑的優勢不及25 ℃下的明顯。

表 3 Purafect Prime 4000L酶活穩定性正交試驗結果（40 ℃）*Tab. 3 Or thogonal test results of activity stability of Purafect Prime 4000L （40 ℃）*

表 4 pH和溫度對蛋白酶酶活穩定性的影響*Fig. 4 Effects of pH and temperature on protease activity*

2. 3 表面活性劑對Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的酶活影響

本實驗選取的洗衣液配方的主表面活性劑是目前常用的陰、非離子表面活性劑（見實驗試劑部分），即AES，AEO7和AEO9。3種表面活性劑在其cmc（25 ℃下以質量濃度表達的cmc分別為：AES，1.065 g/L；AEO7，0.048 g/L；AEO9，0.056 g/L）及更低質量濃度下對酶活的影響見圖2和3。其中，圖3的試驗溶液為AEO和AES的混合表面活性劑溶液，且AEO的質量濃度為 4 g/L （m（AEO7）∶m（AEO9）=1∶1）。

圖2和3表明，陰離子表面活性劑AES對酶活影響較大，而非離子表面活性劑AEO7和AEO9對酶活的影響相對于AES較小。對于混合表面活性劑體系，AEO和AES的混合并不能降低AES對酶活的損傷。因此將來可以考慮在液體加酶洗滌劑中增加APG和AEO的使用。

圖 2 表面活性劑對蛋白酶酶活的影響Fig. 2 Effect of surfactants on protease activity

圖 3 混 合表面活性劑對Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L酶活的影響Fig. 3 Ef fects of mixed surfactants on Purafect 4000L and Purafect Prime 4000L enzyme activities

3 結論

通過考察16種檸檬酸鹽、多元醇及多元醇類非離子表面活性劑對EFFECTENZ P150、Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L在洗衣液中的酶活保持率的影響，發現檸檬酸鹽尤其是檸檬酸銨鈣的穩定效果最佳，APG0810，APG1214的與硼砂接近。進而以檸檬酸銨鈣-APG0810-APG1214復合穩定劑穩定洗衣液中的Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L。較佳復合穩定劑配方為（加酶量為總體系質量的0.5%）：Purafect 4000L，2%檸檬酸銨鈣-1% APG0810-2% APG1214；Purafect Prime 4000L，2%檸檬酸銨鈣-0.5% APG0810-0.5% APG1214。Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的復合穩定劑體系在pH=7和25 ℃下的3周酶活保持率分別可達到84.3%和71.5%；而在pH=8和37 ℃下的3周酶活保持率分別為47.2%和30.4%；硼砂體系pH=7和37 ℃下的3周酶活保持率分別為2.87%和13.5%。

洗衣液中的陰離子表面活性劑AES會相對較大幅度地降低Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的酶活并有劑量效應；非離子表面活性劑AEO7和AEO9對其酶活無顯著影響，但AEO和AES的混合并不能降低AES對酶活的損傷；將來可以考慮在液體加酶洗滌劑中增加APG或AEO系列表面活性劑的使用。