牛奶中32種農(nóng)藥的氣相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法測定

陳美瑜,林竹光

(1.廈門大學 材料學院，高性能陶瓷纖維教育部重點實驗室，福建 廈門 361005；2.廈門大學 化學化工學院 化學系，福建 廈門 361005)

隨著人們生活水平和保健意識的提升，牛奶作為補鈣的最佳途徑之一備受歡迎。牛奶在食物營養(yǎng)鏈中處于較高級，其含有的農(nóng)藥殘留量相對較高，長期食用被農(nóng)藥污染的牛奶能致畸、致癌、致突變，對人體健康危害較大[1]。因此，建立一種準確、靈敏的分析方法來監(jiān)測牛奶中的農(nóng)藥殘留十分必要。測定牛奶中農(nóng)藥殘留常用的分析方法有氣相色譜法[2-3]、液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9-10]等。其中串聯(lián)質(zhì)譜法以“時間串聯(lián)”質(zhì)譜的方式，使用二級質(zhì)譜技術(shù)選擇適合的母離子進行二級質(zhì)譜分析，排除了背景與基質(zhì)干擾，具有定性準確、靈敏度高且成本低廉的特點，已在環(huán)境[11-12]和生物[13-15]分析等領(lǐng)域得到廣泛應用。

本文在前期研究基礎(chǔ)上[16]，建立了GC-IT-MS/MS同時測定牛奶中32種農(nóng)藥殘留的分析方法。本方法操作簡單、抗干擾能力強，適用于目標化合物含量低、基質(zhì)背景復雜的牛奶樣品分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Saturn 2100T GC/MS/MS系統(tǒng)，配備3900氣相色譜和EI與CI兩種電離源；KQ 3200E超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；自制的氮吹濃縮裝置。

乙腈、正己烷、丙酮(農(nóng)殘級，美國Tedia公司)；中性氧化鋁(200～300目)、無水Na2SO4(分析純，國藥集團股份有限公司)；滅線磷、甲拌磷、二嗪磷、乙拌磷、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、皮蠅磷、殺螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、溴硫磷、乙硫磷、α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、艾氏劑、環(huán)氧七氯、狄氏劑、異狄氏劑、p,p’-DDE、p,p’-DDD、p,p’-DDT、聯(lián)苯菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯(中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)；氟氯氰菊酯、內(nèi)標物PCB 103(美國Accu Standard Inc.)。

1.2 GC-MS/MS分析條件

GC分析條件：HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm)；He載氣(>99.999%)；載氣流速：1.00 mL/min；不分流進樣1.00 μL(均采用自動進樣器)；進樣口260 ℃。色譜柱升溫程序：從80 ℃ 以25 ℃/min升至250 ℃，然后以2 ℃/min升至260 ℃，并保持15 min。

MS/MS分析條件：阱溫200 ℃；阱外套40 ℃；傳輸線280 ℃；電子倍增管電壓1 550 V；電子倍增管增益電壓200 V；電離能量70 eV；CI采用甲醇作為反應氣；所有化合物均采用共振激活裂解方式。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備溶液：將13種有機磷農(nóng)藥標準溶液用丙酮稀釋成10.0 mg/L的儲備液，將11種有機氯農(nóng)藥標準溶液、8種擬除蟲菊酯農(nóng)藥標準溶液和內(nèi)標物用正己烷稀釋成10.0 mg/L的儲備液，于4 ℃保存,有效期1年。

混合標準溶液：取適量32種農(nóng)藥儲備液，用正己烷-丙酮(1∶1，體積比)稀釋成32種農(nóng)藥的混合標準溶液，其中有機磷類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、500 μg/L，有機氯類農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L，內(nèi)標物PCB 103的質(zhì)量濃度為10 μg/L。

1.4 樣品前處理方法

準確稱取3.0 g牛奶于100 mL錐形瓶中，加入3.0 g 200～300目的中性氧化鋁及適量的無水硫酸鈉，充分攪勻至半濕狀態(tài)。以15.0 mL乙腈超聲提取15 min，提取液經(jīng)快速定量濾紙過濾；殘渣再用10.0 mL乙腈超聲提取10 min，過濾后合并2次濾液，置于50 ℃恒溫水浴中氮吹濃縮至干，用正己烷-丙酮(1∶1)將其溶解并轉(zhuǎn)移至帶刻度的2.0 mL測試瓶，加入0.4 mL 25 μg/L PCB 103(IS)，定容至1.0 mL，待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件

前處理方法參照本課題組的前期研究成果[16]，采用改進的基質(zhì)固相分散方法，用乙腈作為提取劑。實驗發(fā)現(xiàn)，32種農(nóng)藥的平均加標回收率為71.5%～116%，方法的回收率能滿足痕量農(nóng)藥殘留的分析要求。

2.2 色譜升溫程序

色譜柱升溫程序的設(shè)定，原則上既要保證目標物的完全分離，又要盡量縮短分析時間。但多農(nóng)殘分析對色譜柱的要求極高，且每個目標物均設(shè)定一個流出時間段，將使分析時間過長，不利于多殘留的分析。GC-MS/MS對于多殘留分析中無法完全分離的目標物，提供了多反應監(jiān)測(MRM)的方式，可同時開設(shè)5個不同的離子通道，運用不同的MS/MS分析條件在同一時間段對5種不同目標物進行準確的定性定量分析。32種農(nóng)藥的分離時間見表1。

表1 32種農(nóng)藥和內(nèi)標物的MS/MS質(zhì)譜參數(shù)Table 1 GC-IT-MS/MS parameters for 32 pesticides and internal standard

*quantitation ion

2.3 MS/MS條件的優(yōu)選

在離子阱中，高濃度的目標物可能會使質(zhì)譜譜圖變形，且高濃度目標物優(yōu)化后的MS/MS條件不一定適合于低濃度同種目標物的分析，因而在確定MS/MS分析條件時，選擇中等濃度的32種混合標準樣品(200 μg/L，其中有機氯農(nóng)藥為100 μg/L)優(yōu)化MS/MS分析條件。

圖1 32種農(nóng)藥混合標準溶液的總離子流圖

圖2 乙硫磷在不同阱溫下的GC-MS/MS譜圖

圖3 滅線磷在不同總離子數(shù)下的GC-MS/MS譜圖

2.3.1母離子的選擇MS/MS分析包括兩個過程：母離子的選擇和子離子的形成。目標物或內(nèi)標物進入離子阱，被解離為離子碎片，選擇豐度高、質(zhì)荷比大的離子作為母離子。采用合適的碰撞能量使母離子解離，再選擇合適的子離子進行定量分析。圖1為GC-MS/MS分析32種農(nóng)藥混合標準溶液的總離子流圖(TIC) 。從圖中可以看出，采用GC-MS/MS進行分析時，樣品基質(zhì)和柱流失的干擾小，農(nóng)藥的分析靈敏度較高。

2.3.2共振分析的碰撞誘導解離電壓離子阱中母離子裂解的方式包括共振裂解和非共振裂解。試驗過程中發(fā)現(xiàn)采用非共振裂解方式時母離子裂解的能力較弱，本實驗在共振裂解方式下優(yōu)選碰撞誘導解離(CID)電壓。結(jié)果表明，當CID電壓大于1 V時，大多數(shù)目標物被裂解為質(zhì)荷比較低的子離子，因而CID電壓選擇0～1 V。合適的CID電壓應使MS/MS譜圖中保有適量的母離子及合適豐度的子離子。32種目標物的CID電壓優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.3.3離子阱溫度的選擇離子阱在低溫時對極性較弱的目標物或干擾物的離子具有吸附作用并阻礙離子從離子阱中拋出。由圖2可知，當阱溫為180 ℃時，乙硫磷的GC-MS/MS色譜峰有嚴重的拖尾現(xiàn)象；當阱溫升至200 ℃時，峰拖尾現(xiàn)象明顯改善；當阱溫為220 ℃時，離子流強度值下降，原因可能是高溫使離子碎片部分裂解。因此，本文采用200 ℃作為離子阱的分析溫度。

2.3.4離子源和反應氣總離子數(shù)的選擇化學電離(CI)源是通過在反應過程中引入反應氣，燈絲發(fā)出的電子先將反應氣電離，然后反應氣離子與樣品分子進行離子-分子反應，使目標物形成多1個氫離子的準分子離子。CI源的應用使得MS/MS法可以分析一些分子量較小或穩(wěn)定性較差的不適于EI源分析的化合物。32種農(nóng)藥的離子源方式見表1，除穩(wěn)定性較差的滅線磷、乙拌磷、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、殺螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷和氟氯氰菊酯使用CI源以外，其余的23種農(nóng)藥均采用EI源。

本實驗選擇甲醇作為CI的反應氣并優(yōu)化其總離子數(shù)。圖3是滅線磷在不同離子數(shù)下的GC-CI-MS/MS譜圖，從圖中可以看出，當離子數(shù)較低(675 counts)時，峰響應值較低，信噪比低；當離子數(shù)較高(1 275 counts)時，峰響應值雖高，但背景響應值也升高，使信噪比較低。而選擇875 counts作為反應氣的總離子數(shù)，可使分析的信噪比最高，且能達到較理想的分析結(jié)果。

2.3.5其他MS/MS參數(shù)由于離子化時間越長，目標物的離子化程度越充分，分析的靈敏度越高，故本實驗采用最大離子化時間25 ms(EI)、2 000 μs(CI)。實驗發(fā)現(xiàn)其余參數(shù)對分析靈敏度的影響不大，故采用儀器的缺省值：預掃描時間1 500 μs(EI)，100 μs(CI)；離子阱離子濃度AGC目標值為5 000；離子分離窗口m/z為5。

2.4 線性關(guān)系及方法檢出限

在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件下分別采集“1.3”配制的不同濃度32種農(nóng)藥和內(nèi)標物的GC-MS/MS色譜圖，分別以目標物與內(nèi)標物定量離子的峰面積比(y)對目標物與內(nèi)標物的濃度比(x)作線性分析，得到的線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r)見表2。結(jié)果表明,32種農(nóng)藥在測試濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.994。

按取樣量1.00 g 、定容體積 1.00 mL 、 進樣體積 1.00 μL和信噪比S/N≥3計算，得到各農(nóng)藥的方法檢出限(MDL)見表2。結(jié)果表明,除倍硫磷和毒死蜱的MDL分別為1.7、2.8 μg/kg，其它30種農(nóng)藥的MDL為0.026～1.2 μg/kg。

表2 32種農(nóng)藥和內(nèi)標物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(MDL)、平均回收率及相對標準偏差Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r),method detection limits(MDL)，mean recoveries and RSDs for 32 pesticides and internal standard

2.5 加標回收率與相對標準偏差

稱取3.0 g牛奶空白樣品(32種農(nóng)藥殘留均小于MDL)分別添加相當于牛奶樣品含50、200 μg/kg濃度水平的32種農(nóng)藥混合標準溶液(有機氯類農(nóng)藥的加標濃度水平分別為20、100 μg/kg)，按實驗步驟進行分析(n=5)，各農(nóng)藥的平均加標回收率和相對標準偏差(RSD)見表2。從表中可以看出，各農(nóng)藥的平均加標回收率為71.5%～116%，RSD為1.9%～14%。方法的準確度與精密度符合痕量農(nóng)藥殘留的分析要求。

2.6 方法的選擇性

采用裂解母離子產(chǎn)生的特征子離子對目標物進行定性與定量分析，不易受基體的干擾，因而GC-MS/MS分析結(jié)果靈敏度和可靠性更高。圖4A、B分別為100 μg/L毒死蜱標準溶液和加標100 μg/L毒死蜱的牛奶提取液的MS/MS譜圖，兩圖無明顯差別，可看出該方法消除基體干擾的能力極強，基本不出現(xiàn)基體背景產(chǎn)生的干擾信號。

2.7 實際樣品的檢測

將本方法應用于多種品牌10個牛奶樣品的分析(樣品購于當?shù)卮笮统?，在純牛奶和花生牛奶中檢出p,p’-DDT、氯氰菊酯和氰戊菊酯，其含量分別為5.1～18.6 μg/kg、5.9～15.1 μg/kg和4.8～9.8 μg/kg，均低于GB2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的最大殘留限量[17]。

3 結(jié) 論

本文建立了GC-IT-MS/MS同時測定牛奶中32種農(nóng)藥的分析方法，并系統(tǒng)研究了離子阱串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)對目標化合物檢測結(jié)果的影響。通過優(yōu)化母離子和子離子、CID電壓、離子源溫度、EI/CI電離源、反應氣的總離子數(shù)、離子化時間、預掃描時間、AGC目標值、離子分離窗口，確定了最佳質(zhì)譜條件。該方法無需凈化處理、抗干擾能力強、靈敏度高、選擇性好，方法檢出限為0.026～2.8 μg/kg，實際樣品的加標回收率為71.5%～116%，相對標準偏差為1.9%～14%，可滿足脂肪含量高、基體復雜的牛奶中痕量農(nóng)藥多殘留的快速檢測。