改性納米金富集-毛細管電泳電化學發光法測定水產品中4種氟喹諾酮類藥物殘留

陳宗保，王 星，尹月春，陳國南

(1.上饒師范學院 化學與環境科學學院 江西省高等學校應用有機化學重點實驗室，江西 上饒 334001；2.福州大學 化學學院 食品安全分析與檢測教育部重點實驗室，福建 福州 350116)

氟喹諾酮類藥物(FQs)具有抗菌譜廣、殺菌力強、使用方便,以及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用等特點，因此被廣泛應用于獸禽疾病的防治[1]。但此類藥物的不當和過量使用所導致的藥物殘留會危害人體健康，也會使致病菌產生耐藥性，從而間接危害人類健康。同時，氟喹諾酮類藥物也是水產品中一類重要的藥物殘留污染物[2]。因此，對該類藥物的檢測具有重要意義。目前，檢測氟喹諾酮類藥殘的方法有微生物法、酶聯免疫法(ELISA)[3]、毛細管電泳法(CE)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5-7]、高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)[8-9]、電化學發光法(ECL)[10]。其中，微生物法及酶聯免疫法操作簡單、快速，但靈敏度不高，高效液相色譜及其聯用技術檢測準確、可靠，但檢測儀器昂貴，電化學發光法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、易于控制等特點。毛細管電泳-電化學發光聯用(CE-ECL)技術則結合了毛細管電泳的高效分離和電化學發光的高靈敏度的優點，成為一種快速、經濟、簡便的分離分析技術[11-12]。目前，利用CE-ECL聯用技術檢測氟喹諾酮類藥物的報道甚少[13-14]。

本文利用3-巰基-1-丙胺改性納米金粒子，探索新型富集及CE分離技術。通過優化實驗條件，建立了一種基于改性納米金粒子富集結合CE-ECL技術對4種氟喹諾酮類藥物(環丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)的檢測方法。該方法具有高效、快速、富集倍數高等優點，能夠滿足快速測定痕量氟喹諾酮類藥物的分析要求。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(EN)、氧氟沙星(OF)、諾氟沙星(NOR)標準品(純度均大于98%,上海生工生物工程技術服務有限公司)；六水合三聯吡啶氯化釕[Ru(bpy)3Cl2·6H2O]、Tween-80(Aladdin試劑公司)；二硫蘇糖醇(DTT)、3-巰基-1-丙胺(純度為98%，Adamas試劑公司)；Span-80、Triton X-100(分析純，北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；其它試劑為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

MPI-A型毛細管電泳-電化學發光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限責任公司)；有效長度為67 cm、內徑為50 μm未涂層熔融石英毛細管(河北永年銳灃色譜器件有限公司)；TDZ4-WS型離心機(湖南賽特湘儀廠)；PHS-3C型精密酸度計(上海大普儀器有限公司)；KQ-100型超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q超純水系統(Millipore，Bedford)。

1.2 實驗方法

1.2.1毛細管的活化有效長度為67 cm的毛細管(75 μm×65 cm)分別經0.1 mol/L鹽酸、水、0.5 mol/L氫氧化鈉、PBS緩沖溶液各沖洗30 min。每次進樣間隔需用電泳緩沖液清洗3 min，每進樣5次，依次分別用水、0.5 mol/L氫氧化鈉、水和電泳緩沖液清洗10 min。使用前所有溶液均用0.22 μm濾膜進行過濾，然后經超聲器振蕩以除去溶液中的微小氣泡。

1.2.2納米金的合成及修飾按照Frens的方法[15]合成納米金液：將50.0 mL 2.5×10-4mol/L的 HAuCl4水溶液邊攪拌邊加熱至沸后，一次性加入1.75 mL 10.0 g/L的檸檬酸鈉溶液形成酒紅色，表明得到金納米粒子，繼續攪拌30 min，放置冷卻至室溫。準確移取1.0 mL AuNPs溶液，加入適量3-巰基-1-丙胺溶液，過夜后，離心洗滌1～2次，得到改性金納米沉淀，隨后加入25 mmol/L pH 4.0的PBS緩沖溶液，得到改性的納米金溶液。

1.2.3目標物的富集及分析分別取4種5.0×10-3mol/L 的FQs標準儲備液400 μL于離心管中，用25 mmol/L pH 4.0的PBS緩沖液稀釋至4 mL FQs溶液。將500 μL FQs溶液與500 μL Au溶液混合，其混合液室溫放置1 h后，離心洗滌得沉淀，加入10 μL新制的1 mol/L DTT釋放劑，再懸浮以充分釋放富集的目標物，室溫放置20 min后離心洗滌，去除沉淀物，所得上清液上機分析。

1.2.4樣品處理準確稱取勻漿成糊狀的鰻魚魚肉10.0 g，加入5.0 g無水硫酸鈉，每次加15.0 mL乙腈，分別提取3次，合并提取液，離心，取上清液至圓底燒瓶。向燒瓶中加入6.0 mL正丙醇，旋干，加入2.0 mL乙腈-水(40∶60)混合液，再加入2.0 mL乙腈飽和正己烷溶液，振蕩均勻，離心分層，取下層液體，用0.22 μm微孔濾膜過濾，待富集后測定。

2 結果與討論

2.1 富集原理及倍數

納米金粒子具有小粒徑、大比表面積，很高的界面活性等特點，而氟喹諾酮類藥物均具有羧基(—COOH)的特殊結構。為使納米金能較好地富集目標物，實驗采用3-巰基-1-丙胺對納米金進行表面修飾，使其帶上氨基(—NH2)，在酸性條件下，修飾有氨基的AuNPs可與帶有羧基的FQs藥物進行多位點的氫鍵作用，使之富集聚沉。隨著DTT釋放劑的加入，可使富集的目標物游離出來，從而實現目標物的分離檢測，其示意圖如圖1所示。

圖1 改性納米金富集恩諾沙星的原理圖

2.2 方法的可行性

2.3 ECL檢測條件的選擇

圖2 緩沖液pH值對電化學發光強度的影響

圖3 分離電壓對分離的影響

圖4 緩沖液濃度對分離的影響

圖5 進樣電壓對發光強度及分離度的影響

2.4 電泳分離條件的選擇

2.4.1分離電壓的優化在毛細管電泳中進行高通量分析檢測時，分離電壓對分析物的檢測時效及分離效果有較大影響。在實際分析中，常采用較高的分離電壓以加快分析速度并提高分離度，但過高的電壓會對多組分的分離造成不良影響。因此，實驗考察了10～20 kV范圍內不同分離電壓對分離度及電流值的影響(圖3)。結果表明，隨著分離電壓的增大，電流和分離度(RS)均呈上升趨勢，并在分離電壓為14 kV和16 kV時，4種分析物可實現有效分離，且分離電壓為16 kV時，分離度更高，電流值更大。繼續增大分離電壓時，分離度下降，而電流信號雖增加，但基線噪聲信號增強，不利于分離。故實驗選擇最佳分離電壓為16 kV。

2.4.2緩沖液濃度的優化緩沖溶液的濃度由于會影響緩沖體系的離子強度，從而改變溶質與管壁之間和被分離組分之間的相互作用，故其影響不可忽視。實驗考察了PBS溶液濃度分別為15、20、25、30、35 mmol/L時對電流響應值和分離效果的影響(見圖4)。實驗發現隨著電泳緩沖液濃度的逐漸增大，電流值平穩增加，而分離效果則呈倒“U”型變化，當電泳緩沖溶液濃度為20～30 mmol/L時基線平穩，分離效果較好，但當電泳緩沖溶液濃度大于25 mmol/L時，其基線噪聲信號明顯增強，電泳圖譜峰出現峰刺、展寬現象，故實驗選擇PBS緩沖液的最佳濃度為25 mmol/L。

2.4.3進樣時間及電壓的優化實驗CE-ECL儀器裝置采用可編程的高壓電源(0～20 kV)電動進樣模式，研究表明，進樣量決定性地影響著分離度及檢測靈敏度。考慮到延長進樣時間時，進樣量增多，造成組分擴散，峰形變寬，分離效率降低，因此實驗固定進樣時間為10 s，考察了不同電動進樣電壓(6、8、10、12、14、16 kV)對電化學發光強度及分離效率的影響(圖5)。實驗表明，隨著進樣電壓的逐漸升高，電化學發光信號增強程度由快到慢，而分離度則相反，在進樣電壓由低到高的變化過程中，分離度逐漸下降，大于12 kV時，分離度RS小于1.5,表明無法完全分離。故在控制一定進樣量(進樣時間10 s)時,實驗選擇12 kV為最佳進樣電壓。

圖6 4種藥物在最優條件下的電泳分離譜圖

2.5 富集倍數

在緩沖溶液pH=3.0～4.0，AuNPs用量1 mL時，將200 μL 0.5 mmol/L 3-巰基-1-丙胺修飾劑與0.2 mmol/L Triton X-100改性劑用于富集樣品濃度為1.0×10-5mol/L的混合標準樣品，平行測定3次。結果表明，CIP、EN、OF、NOR 4種分析物的平均富集倍數分別為104、127、111和106倍。表明該方法可以提高的靈敏度。

2.6 線性范圍、檢出限及方法精密度

以乙腈與水(3∶7)混合液為稀釋劑，分別將CIP、EN、OF和NOR 4種標準儲備液稀釋成一系列濃度(0.05～10 μmol/L)工作液。在最佳條件下富集后，依次進行分析檢測。以峰高(y)對濃度(x，μmol/L)作圖，分別得到CIP、EN、OF和NOR的線性方程、相關系數、線性范圍及檢出限(LOD)，結果如表1所示。4種分析物在一定濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r)均大于0.992，以信噪比S/N≥3的濃度計算其檢出限(LOD),各分析物的LOD均不大于0.05 μmol/L。在最優條件下，同1天內連續6次對不同濃度水平的加標鰻魚樣品進行CE-ECL分析，依據CIP、EN、OF、NOR的峰高及保留時間計算日內平均相對標準偏差(RSD)，4種分析物的峰高RSD均不大于8.3%，保留時間RSD均小于7.2%。

表1 CIP、EN、OF、NOR的線性范圍、線性方程、相關系數(r)及LODsTable 1 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r) and LODs of CIP,EN,OF and NOR

2.7 樣品分析及回收率實驗

鰻魚樣品經“1.2.4”方法處理后，在最優條件下，采用改性納米金預富集方法對加標后的鰻魚提取液進行分析，在實際樣品中未檢測出4種分析物。在實際樣品中直接添加兩種水平(20、50 μmol/L)的標準溶液，回收率結果如表2所示。結果表明4種分析物的樣品回收率為94.5%～112%，RSD均不大于6.3%。因此，該方法可用于實際樣品中4種藥物殘留的同時檢測。

表2 鰻魚樣品的回收實驗(n=3)Table 2 Recovery test of the spiked eel sample(n=3)

3 結 論

本文采用改性納米金顆粒對4種FQs藥物進行富集，結合CE-ECL檢測技術，建立了一種高靈敏分析檢測FQs藥物的方法。對富集與分離條件進行優化，在優化條件下，該方法的檢出限可達0.02 μmol/L，應用于實際鰻魚樣品的檢測，效果良好。