基于核磁共振氫譜及偏最小二乘判別分析法的紅木快速識別模型的建立與應(yīng)用

陳碧瑩，廖世莉，吳 霞，馮毅凡

(廣東藥科大學(xué) 中心實驗室，廣東 廣州 510006)

紅木作為珍貴的家具用材，制作而成的家具和工藝品等備受青睞，價值極高[1]。根據(jù)國家紅木標準(GB/T 18107-2000)[2]，可將紅木分為5屬8類，共29種。不同種類、不同產(chǎn)地的紅木之間價格差異較大。目前紅木鑒別仍以人工鑒別為主，而人工鑒別能力參差不齊，加之市場上真假紅木魚目混珠，使得消費者不能有效地識別真?zhèn)危自斐蓳p失。國標紅木中俗稱為小葉紫檀的檀香紫檀，在市場上價格較高，而染料紫檀因價格低廉、形似檀香紫檀的特點，常被混作檀香紫檀。膠漆樹也因外觀類似紫檀，常被冒充作為紅木使用。

目前常用的傳統(tǒng)鑒別紅木的方法為觀測紅木木材的材色、紋理、氣味及其顯微結(jié)構(gòu)等[3-5]。近年來，化學(xué)檢測手法也被逐步應(yīng)用于紅木鑒別。紅外光譜法[6-9]和氣相色譜法[10-12]是目前較為常用的鑒別紅木的化學(xué)方法，但兩者均易受儀器和環(huán)境影響，且氣相色譜法的樣品前處理較繁瑣。

核磁共振技術(shù)具有檢測快速、樣品處理簡單、靈敏度高、無偏向性等優(yōu)點，其中，核磁共振氫譜被越來越多地應(yīng)用于植物指紋圖譜的構(gòu)建[13]。而僅靠人工鑒別對核磁共振儀這種高通量儀器所產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)進行分類不僅不現(xiàn)實，還會丟失大部分有用的信息[14]。模式識別方法結(jié)合了計算機、統(tǒng)計學(xué)、數(shù)學(xué)等知識，從化學(xué)測量數(shù)據(jù)出發(fā)，進一步揭示物質(zhì)的隱含性質(zhì)，可有效地解決數(shù)據(jù)處理的難題[15]，為分析化學(xué)研究提供十分有用的決策性信息。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法是模式識別中常用的方法之一。

本研究將1H NMR與PLS-DA結(jié)合，對奧氏黃檀、巴里黃檀、交趾黃檀、刺猬紫檀、大果紫檀和檀香紫檀6類國標紅木，及膠漆樹、染料紫檀2類混淆品進行快速鑒別，嘗試建立有效區(qū)分上述6類國標紅木及其2類混淆品的有效方法。

1 實驗部分

1.1 實驗樣本

實驗樣本名稱及其來源如表1所示。建模所需的8類共75批次的樣本和從市場上購得的未知樣本X-1和X-2均取自木材心材部分，研磨，過40目篩，置于干燥器中常溫保存。

表1 樣本名稱及其來源Table 1 Name and resource of samples

1.2 儀器與試劑

AVANCE Ⅲ500MHz 超導(dǎo)NMR波譜儀(瑞士Bruker公司)，正相檢測探頭(BBO多核寬帶探頭，瑞士Bruker公司)，MestReNova軟件，5 mm直徑核磁管(美國Norell公司)，氘代甲醇MeOD(美國Sigma公司)。AUWD220D型分析天平(日本島津公司)，1 000 μL移液槍、高速離心機(美國Thermo公司)，KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品溶液的制備稱取0.1 g樣品，加入1 mL氘代甲醇，超聲30 min，13 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管，加封，即得核磁測試供試品。

1.3.21HNMR光譜分析儀器工作條件：溫度：295 K；頻率：500.13 MHz；序列：zgpr(預(yù)飽和單脈沖)；90°脈沖寬度：14 μs；掃描次數(shù)：24；掃描譜寬：16 ppm(1H NMR)；弛豫延遲：1.0 s；時域數(shù)據(jù)點數(shù)：64 k。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.11HNMR數(shù)據(jù)處理使用MestReNova軟件，將1H NMR圖譜分別進行相位矯正、基線矯正、扣除溶劑峰和水峰、歸一化和分段積分(0.04 ppm)等處理，導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.4.2模式識別分析使用RStudio 3.3.2軟件和mixOmics 6.3.0包，對導(dǎo)出的核磁數(shù)據(jù)進行聚類分析、PCA和PLS-DA處理(參數(shù)設(shè)置：center=FALSE，scale=FALSE，其余參數(shù)選取默認值)。

2 結(jié)果與討論

2.1 6類國標紅木及2類混淆品的1H NMR圖

經(jīng)過相位矯正、基線矯正、扣除溶劑峰和水峰等處理的6類國標紅木及2類混淆品的1H NMR圖譜如圖1所示，圖中隨機選取8類樣本的1H NMR圖譜構(gòu)建疊加圖。由圖可知，不同種類間紅木甲醇提取液的1H NMR圖有較大差異，因此，利用化學(xué)檢測手段將其分類具有可行性。

圖1 6類國標紅木及2類混淆品的1H NMR圖

2.2 紅木分類模型的建立

2.2.16類國標紅木及2類混淆品紅木的聚類分析結(jié)果聚類分析根據(jù)相類似的樣本在多維空間中彼此的距離小，不相似的樣本在多維空間中彼此的距離大而達到分類的目的。6類國標紅木及2類混淆品紅木的聚類分析結(jié)果如圖2所示，圖中顯示了8組共75個樣本。由圖可知，刺猬紫檀(P.eri.)組、染料紫檀(P.tin.)組、大果紫檀(P.mac.)組和膠漆樹(G.sp.)組能較好地分組，其余各組間或有交集，并不能很好地進行區(qū)分。聚類分析能有效地將混淆品組與國標紅木組進行有效區(qū)分，但不同類別間的國標紅木組并不能得到有效地分類。

圖2 6類國標紅木及2類混淆品的聚類分析結(jié)果

圖3 6類國標紅木及2類混淆品的PCA結(jié)果

2.2.26類國標紅木及2類混淆品紅木的PCA結(jié)果6類國標紅木及2類混淆品紅木的PCA結(jié)果如圖3所示。由圖可知，PCA轉(zhuǎn)換后PC1和PC2的貢獻率分別為56%和15%，累積貢獻率達71%。貢獻率越大，表明其所含的信息越多，越能代表原始的數(shù)據(jù)。在PCA模型中，除大果紫檀組能較好地分組外，其余各組間或有交集，國標紅木組與混淆品組、不同類別的國標紅木組間均不能達到較好地區(qū)分。因此，PCA不適用于紅木的快速鑒別分析。

2.2.36類國標紅木及2類混淆品紅木的PLS-DA結(jié)果PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法,能減少變量間多共線性所產(chǎn)生的影響，即自變量間的共線性越低，使用PLS-DA的效果越好。本文中1H NMR譜圖所產(chǎn)生的信號為提取物信號，提取物間的共線性較低，且PLS-DA易于識別系統(tǒng)信息和噪音，可得到更好的分類效果。6類國標紅木及2類混淆品紅木的PLS-DA結(jié)果如圖4所示。由于樣本類別較多，使用三維圖譜能更客觀地反映分類模型的性能，因此，選擇前3個主成分建立模型。PLS-DA的PC1、PC2和PC3分別為33%、28%和18%，累積貢獻率達79%。由圖4B可知，膠漆樹組和染料紫檀組2類混淆品能與國標紅木組進行良好地區(qū)分，除交趾黃檀組分別與奧氏黃檀組和檀香紫檀組間存在少量交集外，其余國標紅木間都能得到很好地區(qū)分。因此，PLS-DA適用于紅木的快速鑒別分析。

為探究紅木PLS-DA模型的實用性，本研究從市場上搜集2個未知樣本，信息如表1所示。將未知樣本分別經(jīng)“1.3”和“1.4”步驟處理后，所得結(jié)果如圖5所示。未知樣本X-1和X-2分別為從市場購得的未經(jīng)鑒別的絨毛黃檀和交趾黃檀。由圖5可知，樣本X-1游離于識別模型的8個類別之外，證明其不屬于本研究中的6類國標紅木或2類混淆品類別；樣本X-2在模型中被歸入交趾黃檀組別中，與市場購入的標識組別相一致。因此，本研究基于PLS-DA構(gòu)建的紅木快速識別模型對未知樣本也有較好的分類效果。

進一步分析PLS-DA模型所使用的PC1、PC2和PC3的組成，其前15個權(quán)重大的變量如圖6所示。在δH1.18～1.26、δH3.70～3.90，δH6.66～6.70，δH6.74～6.82和δH6.86～6.90處各類樣品間有較大的差異。根據(jù)文獻可知[10,17]，紅木的甲醇提取物中富含黃酮類成分，本實驗中1H NMR譜圖的特征峰與黃酮類化合物相符。因此，可初步判斷δH1.18～1.26處為取代烷基上的H原子信號，δH3.70～3.90處為與苯基相連的取代氧甲基上的H原子信號，δH6.66～6.70、δH6.74～6.82和δH6.86～6.90處為與苯基直接相連的H原子信號。

在8類樣本中，不同變量的最大表達和最小表達如圖6所示。大果紫檀在δH1.18～1.26中具有最大的表達，即可認為在δH1.18～1.26處具有特征信號的化合物在大果紫檀組別中的含量應(yīng)為最大。與此相反，巴里黃檀和奧氏黃檀分別在δH1.18～1.22、δH1.22～1.26中有最小的表達。由此可初步推斷，δH1.18～1.26是區(qū)分大果紫檀和巴里黃檀、奧氏黃檀的主要特征區(qū)間。

交趾黃檀在δH3.70～3.74和δH3.86 ～3.90處具有最大的表達，刺猬紫檀在δH3.74～3.78處具有最大的表達，染料紫檀在δH3.78～3.86中具有最大的表達。與此相反，刺猬紫檀在δH3.70～3.74中具有最小的表達，膠漆樹在δH3.74～3.90中具有最小的表達。由此可初步推斷，δH3.74～3.90是區(qū)分混淆品膠漆樹與其余組別的主要特征區(qū)間，而δH3.70～3.74是區(qū)分交趾黃檀與刺猬紫檀的主要特征區(qū)間。

染料紫檀在δH6.66～6.70中具有最大的表達，膠漆樹在δH6.74～6.82中具有最大的表達，刺猬紫檀在δH6.86～6.90中具有最大的表達。與此相反，刺猬紫檀在δH6.66～6.70和δH6.74～6.82中有最小的表達，大果紫檀在δH6.86～6.90中具有最小的表達。由此可初步推斷，δH6.66～6.70和δH6.74～6.82是區(qū)分混淆品染料紫檀、膠漆樹與刺猬紫檀的主要特征區(qū)間，δH6.86～6.90是區(qū)分刺猬紫檀和大果紫檀的主要特征區(qū)間。

圖4 6類國標紅木及 2類混淆品PLS-DA分類結(jié)果的2D(A)和3D(B)圖

3 結(jié) 論

本研究采用核磁共振技術(shù)和PLS-DA模式識別方法對8類共75批次的紅木核磁共振氫譜數(shù)據(jù)進行處理，建立了核磁共振技術(shù)與模式識別方法相結(jié)合的紅木快速鑒別新方法。結(jié)果表明，PLS-DA適用于紅木的快速鑒別分析，能有效地區(qū)分國標紅木及其混淆品，除交趾黃檀組分別與奧氏黃檀組和檀香紫檀組間存在少量交集外，其余國標紅木均能得到很好地區(qū)分。該方法具有快速、靈敏度高、準確等優(yōu)點，不受主觀因素、環(huán)境和儀器的影響，是一種快速鑒別紅木種類的可行之法。