蝦源枯草芽孢桿菌生長動力學與抑制效應評價

劉玲，郭全友，李保國，姜朝軍

1(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海,200093) 2(中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)

南美白對蝦是當今全球養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一。熟制南美白對蝦蝦仁在儲藏過程中易被微生物污染而導致腐敗變質(zhì)。人們將生存能力強、繁殖快，且產(chǎn)生腐敗臭味代謝產(chǎn)物的特定菌群稱為特定腐敗菌[1]。對蝦的優(yōu)勢腐敗菌與其品質(zhì)和貨架期之間存在密切關系，在實際生產(chǎn)過程中往往可通過控制優(yōu)勢腐敗菌生長繁殖來改善產(chǎn)品品質(zhì)，延長其貨架期。研究表明枯草芽孢桿菌是低酸性罐頭[2]、肉制品[3]及水產(chǎn)品[4]等多種熟制食品的優(yōu)勢腐敗菌。林進[5]研究表明枯草芽孢桿菌是熟制南美白對蝦的優(yōu)勢腐敗菌之一。鄭麗君等[6]通過測定免泡豆桿中腐敗代謝產(chǎn)物(TVB-N)的產(chǎn)量因子為35.38(mg/100 g)，確定枯草芽孢桿菌是致腐能力較強的腐敗菌之一，因此抑制及預測枯草芽孢桿菌的生長對評估水產(chǎn)品儲藏及安全具有重要意義。

預測微生物學用于描述和預測微生物在一定條件下的生長情況，可對食品安全做出快速評估。其中預測微生物一級模型主要表征微生物數(shù)量與時間函數(shù)的關系[7]；二級模型主要表達通過一級模型得到的參數(shù)與環(huán)境因子變量之間的函數(shù)關系[8]；目前微生物生長動力學模型構建及參數(shù)獲取仍通過平板計數(shù)法，該法準確度高，但費時費力。WANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過OD-TTD值測定金黃色葡萄球菌的生長曲線時，OD值與菌落總數(shù)成線性關系(R2=0.999 7)，且該值可通過Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型和3PLM模型進行計算。劉珊娜等[10]通過測定單增李斯特菌菌株在不同培養(yǎng)條件下菌液的OD600 nm值，繪制生長曲線并建立生長模型。吸光度法以其檢測速度快和高通量等優(yōu)勢日益受到學者關注[11]。有研究表明，ε-聚賴氨酸和Nisin對枯草芽孢桿菌具有協(xié)同抗菌效應[12]。近年有學者多采用Aw、pH、鹽分及儲藏溫度[7，11，13]等變化預測腐敗菌的生長狀況，但采用生物因子作為生長調(diào)控因子的生長動力學模型較為少見。

本文以分離自熟制南美白對蝦中的優(yōu)勢腐敗菌(枯草芽孢桿菌)為對象，研究pH和生物因子對枯草芽孢桿菌生長的影響，采用OD值測量法，用修正Compertz模型進行數(shù)據(jù)擬合并構建一級模型，根據(jù)分析所得數(shù)據(jù)對最大比生長速率的μmax值和遲滯期λ構建二級模型，為有效抑制枯草芽孢桿菌的生長，延長熟制南美白對蝦貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HCl標準溶液(0.01 mol/L)，深圳市博材達科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂(AR)、甘油、營養(yǎng)肉湯(BR)、NaCl(AR)，上海市國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C微生物生長測定儀，芬蘭Oy GrowTh Ab Ltd.；pHS-3C pH計，上海雷磁儀器廠； SW-CJ-1FB潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ZM-100反壓蒸煮消毒鍋，廣州標際包裝設備有限公司；ZHWY-200H恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 菌種來源與菌懸液制備

1.3.1 菌種來源

真空包裝熟制對蝦蝦仁(采購于寧德市某水產(chǎn)公司)貨架期終點時分離純化出優(yōu)勢菌株，經(jīng)MIDI細菌鑒定系統(tǒng)(Microbial ID Inc.,美國)和BIOLOG細菌鑒定系統(tǒng)(Biolog公司，美國)和16S rRNA測序(KU570452.1)[14]鑒定為枯草芽孢桿菌，凍干，4 ℃貯藏，待用。

1.3.2 菌懸液制備

菌株活化：取枯草芽孢桿菌接種于無菌營養(yǎng)肉湯中，振蕩30s，37 ℃培養(yǎng)24 h，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中劃線得到單菌落。

菌懸液制備：挑取單菌落，接種到10 mL無菌營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL培養(yǎng)液至9 mL無菌生理鹽水中得到10-1菌懸液，逐級稀釋，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6梯度菌懸液，各取0.1 mL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，選取菌量約105CFU/mL菌懸液作為接種液。

1.4 方法

參考文獻[12，14]設計pH值為 4.0、4.6、5.0、6.0和7.0五個水平。設計ε-聚賴氨酸和Nisin濃度值皆為20、60、100、140和180 μg/mL 5個水平(溶液設定pH=5.0)。調(diào)節(jié)過pH、生物因子濃度的營養(yǎng)肉湯溶液經(jīng)121 ℃滅菌處理，每孔180 μL接入微孔板中，取105CFU/mL的接種液20 μL，確定最終接種液濃度為104CFU/mL左右，接種入孔，每個條件3組平行，1個空白，在微生物生長測定儀中速37 ℃振蕩培養(yǎng)，7 d內(nèi)間隔1h測定OD600nm值。

1.5 蝦源枯草芽孢桿菌一級模型的建立

選擇修正的Gompertz方程式(1)[15]對實驗數(shù)據(jù)進行擬合。

(1)

式中：t為時間，h；ODt為t時的吸光度值，ODmin為最小OD值；A為菌數(shù)增長的對數(shù)值；μmax為最大比生長速率,h-1；λ為遲滯期,h。

1.6 蝦源枯草芽孢桿菌二級模型的建立

本研究基于一級生長模型中所得到的蝦源枯草芽孢桿菌的μmax值和λ值，選取平方根模型(式2、式3)[7]對蝦源枯草芽孢桿菌的二級生長模型進行擬合。

(2)

(3)

式中：b為方程常數(shù)；T為溫度，℃；Tmin為生長最低溫度，℃，即在此溫度時最大比生長速率為零；λ為遲滯期；μ為比生長速率。

ZWIETERING等[16]提出pH值對微生物生長速率的影響可以用平方根經(jīng)驗模型式(2)和式(3)來描述，同樣的ε-聚賴氨酸濃度及Nisin濃度對微生物速率的影響也可以用式(2)和式(3)來描述。

1.7 模型可靠性評價

通過判定系數(shù)R2，均方誤差(root mean square error，RMSE)，偏差因子(bias factor，Bf)和準確因子(accuracy factor，Af)[13]來進行驗證。

(4)

(5)

(6)

式中：y實測為實測值；y預測為預測值；n為實測值個數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復3次，結果采用平均值±標準偏差，采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理及計算。按照修正Compertz模型進行擬合，采用Origin 9.0(美國OriginLab公司)對數(shù)據(jù)進行處理分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 pH脅迫作用對枯草芽孢桿菌生長情況及生長動力學參數(shù)的影響

2.1.1 不同pH下枯草芽孢桿菌的生長曲線和一級模型的建立

微生物能在較廣范圍pH下生長，一般細菌可在pH 5.0～9.0生長。極端pH能改變細胞膜通透性，破壞細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)從而造成細胞死亡[11]。孫力軍等[18]發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌中提取的抗菌肽在pH 2.0～12.0具有廣泛的適應范圍，SASITHORN等[15]研究發(fā)現(xiàn)提取自一株新型枯草芽孢菌的蛋白酶能在pH 3.0～12.0維持最大活性的80%。

在37 ℃下，采用Origin 9.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)并通過修正Compertz模型擬合的枯草芽孢桿菌生長曲線，pH 4.0～7.0時，呈現(xiàn)出S型生長曲線，如圖1所示，模型評價中R2均大于0.960，Af在1.030～1.040，Bf在0.970～1.020，RMSE在0.000～0.100，生長模型擬合優(yōu)度良好。

圖1 37 ℃時不同pH下枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis at different pH at 37 ℃注：圖中pH值均為實測值。

修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同pH下的生長參數(shù)值如表1，37 ℃時，最大比生長速率隨pH增大而增大，pH為4.0時，最大比生長速率為0.023 h-1，pH為6.0時，最大比生長速率增至0.186 h-1，pH=6.0～7.0時，最大比生長速率變化不顯著，在0.184～0.186 h-1(表1)。

表1 37 ℃時修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同pH下的生長參數(shù)值Table 1 Correction of growth parameter values of Bacillus subtilis modified by Gompertz at different pH values at 37 ℃ model

37 ℃時，遲滯期也隨pH增大而縮短，pH 4.0時遲滯期最長，為127.0 h，pH增至4.6時，遲滯期降至36.8 h，pH為6.0～7.0時，遲滯期為4.8～5.3 h，變化較不顯著。和LEE等[19]研究結果比較發(fā)現(xiàn)，多黏芽孢桿菌最佳生長為pH 5.0～9.0，在pH 4.0的肉湯中觀察到細菌計數(shù)減少約4個對數(shù)周期吻合。由最大比生長速率及遲滯期的數(shù)據(jù)表明，pH對枯草芽孢桿菌生長影響顯著，低pH降低最大比生長速率并延長遲滯期，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

2.1.2 pH對生長動力學參數(shù)的影響及二級模型的建立

A-生長速率;B-遲滯期圖2 平方根模型擬合蝦源枯草芽孢桿菌最大比生長速率、遲滯期與生長pH的關系曲線Fig.2 Square root model fitting the maximum specific growth rate,lag time and growth pH of shrimp-derived Bacillus subtilis

2.2 ε-聚賴氨酸脅迫作用對枯草芽孢桿菌生長情況及生長動力學參數(shù)的影響

2.2.1 不同ε-聚賴氨酸濃度下枯草芽孢桿菌的生長曲線和一級模型的建立

ε-聚賴氨酸是白色鏈球菌的代謝產(chǎn)物，其抑菌譜廣，作用機理為破壞細胞膜、細胞壁、遺傳物質(zhì)、酶或功能蛋白、抑制細菌的呼吸作用，從而達到抑菌目的[20-21]。如圖3所示，模型評價中R2均大于0.970，Af在1.000～1.100，Bf在0.950～1.040，RMSE在0.000 ～0.100，生長模型擬合優(yōu)度良好。

圖3 37 ℃時不同ε-聚賴氨酸濃度下枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.3 Bacillus subtilis growth curve at different ε-polylysine concentrations at 37 ℃注：ε-聚賴氨酸濃度為實測值。

修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同ε-聚賴氨酸濃度下的生長參數(shù)值如表2，37 ℃，pH=5.0 時，最大比生長速率隨ε-聚賴氨酸濃度增大而減小，ε-聚賴氨酸濃度為20 μg/mL時，最大比生長速率為0.096 h-1，ε-聚賴氨酸濃度為100 μg/mL時，最大比生長速率增至0.060 h-1，ε-聚賴氨酸濃度增至180 μg/mL之間時，最大比生長速率降至0.034 h-1。

表2 37 ℃時修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同ε-聚賴氨酸濃度下的生長參數(shù)值Table 2 Correction of growth parameter values of different ε-polylysine concentrations of Bacillus subtilis obtained by fitting Gompertz model at 37 ℃

遲滯期隨ε-聚賴氨酸濃度增大而增大，ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度180 μg/mL時遲滯期最長，為73.9 h，ε-聚賴氨酸濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至7.4 h。與LI等[22]研究結果：在pH 5～8時，ε-聚賴氨酸對枯草芽孢桿菌具有較好的抑菌效力結果相似。與修艷輝[23]研究0.012 5%～0.2%聚賴氨酸作用于腐敗希瓦氏菌，最大比生長速率從0.202 h-1下降至0.088 h-1，遲滯期從1.4 h增大至6.7 h趨勢吻合。由最大比生長速率及遲滯期的數(shù)據(jù)表明，ε-聚賴氨酸濃度對枯草芽孢桿菌生長影響顯著，高ε-聚賴氨酸濃度降低最大比生長速率并延長遲滯期，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

2.2.2 ε-聚賴氨酸對生長動力學參數(shù)的影響及二級模型的建立

A-生長速率；B-遲滯期圖4 平方根模型擬合蝦源枯草芽孢桿菌最大比生長速率、遲滯期 與生長ε-聚賴氨酸濃度的關系曲線Fig.4 Square root model fitting the relationship between maximum specificgrowth rate,lag time and growth ε-polylysine concentration of shrimp-derived Bacillus subtilis

2.3 Nisin脅迫作用對枯草芽孢桿菌生長情況及生長動力學參數(shù)的影響

2.3.1 不同Nisin濃度下枯草芽孢桿菌的生長曲線和一級模型的建立

Nisin能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖，有研究結果報道Nisin對枯草芽孢桿菌的抑菌效果較好[24]。如圖5所示，模型評價中R2均大于0.986，Af在1.010～1.050，Bf在0.980～1.000，RMSE在0.000～0.100，生長模型擬合優(yōu)度良好。

圖5 37 ℃時不同Nisin濃度下枯草芽孢桿菌生長曲線Fig.5 Growth curve of Bacillus subtilis at different concentrations of Nisin at 37 ℃注：Nisin濃度為實測值。

修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同ε-聚賴氨酸濃度下的生長參數(shù)值如表3。37 ℃時，最大比生長速率隨Nisin濃度增大而減小，Nisin濃度為20～100 μg/mL時，最大比生長速率變化較不顯著，在0.078～0.084 h-1，Nisin濃度為140 μg/mL時，最大比生長速率降至0.043 h-1，Nisin濃度為180 μg/mL 時，7d內(nèi)OD值無顯著差異，μmax≤0.001,判定枯草芽孢桿菌不生長[11]。同時，遲滯期也隨Nisin濃度增大而增大， Nisin濃度140 μg/mL時遲滯期最長，為131.8 h，Nisin濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至21.7 h。該結果與KHALIL等[25]研究25～100 IU/mL Nisin單獨處理枯草芽孢桿菌，隨濃度增加，OD600 nm繪制的生長曲線遲滯期增加，最大比生長速率減小。且使用低濃度的Nisin可能減少乳酸鏈球菌肽抗性細菌亞群的出現(xiàn)。由最大比生長速率及遲滯期的數(shù)據(jù)表明，Nisin濃度對枯草芽孢桿菌生長影響顯著，高Nisin濃度減小最大比生長速率并延長遲滯期，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

表3 37 ℃時修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同pH下的生長參數(shù)值Table 3 Correction of growth parameter values of Bacillus subtilis at different pH values at 37 ℃ modified by Gompertz model

注：“/”代表菌株未生長。

2.3.2 Nisin對生長動力學參數(shù)的影響及二級模型的建立

采用平方根模型作為二級模型擬合Nisin濃度對微生物生長的影響如圖6。

A-生長速率;B-遲滯期圖6 平方根模型擬合蝦源枯草芽孢桿菌最大比生長速率、遲滯期與生長Nisin濃度的關系曲線Fig.6 The relationship between the maximum specific growth rate,the lagtime and the growth Nisin concentration of the shrimp source Bacillus subtilis model

3 結論

以蝦源枯草芽孢桿菌為對象，通過調(diào)控不同環(huán)境因子(pH、ε-聚賴氨酸和Nisin)研究其生長規(guī)律，并建立了枯草芽孢桿菌的一級和二級生長模型，選取修正Compertz模型作為描述不同條件下蝦源枯草芽孢桿菌生長動力學參數(shù)的一級生長模型，模型評價中R2均大于0.960，Af均在1.000～1.100，Bf均在0.950～1.040，RMSE均在0.000～0.100，生長模型擬合優(yōu)度良好。

根據(jù)修正Gompertz模型擬合得到的枯草芽孢桿菌不同調(diào)控因子下的生長參數(shù)值得出，枯草芽孢桿菌最大比生長速率隨pH增大而增大，而遲滯期卻縮短。pH為4.0時，最大比生長速率為0.023 h-1，遲滯期最長，為127.0 h；pH為6.0時，最大比生長速率增至0.186 h-1，pH 6.0～7.0時，最大比生長速率在0.184～0.186 h-1，遲滯期為4.8～5.3 h，變化不顯著。

最大比生長速率隨ε-聚賴氨酸濃度增大而減小，ε-聚賴氨酸濃度為20 μg/mL時，最大比生長速率為0.096 h-1，ε-聚賴氨酸濃度為100 μg/mL時，最大比生長速率為0.060 h-1，ε-聚賴氨酸濃度增至180 μg/mL之間時，最大比生長速率降至0.034 h-1。遲滯期隨ε-聚賴氨酸濃度增大而延長，ε-聚賴氨酸濃度180 μg/mL時遲滯期最長，為73.9 h，ε-聚賴氨酸濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至7.4 h。

最大比生長速率隨Nisin濃度增大而減小，Nisin濃度為20～100 μg/mL時，最大比生長速率變化較不顯著，在0.081～0.084 h-1，Nisin濃度為140 μg/mL時，最大比生長速率降至0.043 h-1，Nisin濃度為180 μg/mL 時，枯草芽孢桿菌不生長。遲滯期也隨Nisin濃度增大而增大， Nisin濃度140 μg/mL時遲滯期最長，為131.8 h，Nisin濃度降至20 μg/mL時，遲滯期降至21.7 h。

根據(jù)平方根模型能夠較準確預測蝦源枯草芽孢桿菌的生長狀況。R2分別為0.894和0.908。可見平方根模型能較好擬合不同調(diào)控因子與最大比生長速率、遲滯期之間的關系。