烏蘇里瓦韋對小鼠鎮咳、祛痰作用研究

譚靜，林紅強，吳福林，鄭炳真，董慶海，李平亞，劉金平，王涵

（吉林大學藥學院天然藥物研究中心，長春 130021）

烏蘇里瓦韋為蕨類水龍骨科（Polypodiaceae）瓦韋屬（Lepisorus）植物烏蘇里瓦韋〔Lepisorus ussuriensis（Regel et Maack）Ching〕的干燥全草，別名騸雞尾、石茶、樹茶、鐵包針、劍刀草、大石韋等，主要分布于吉林省、黑龍江省、安徽省、河南省、山東省、河北省、遼寧省等海拔750～1 700 m地區，附生林下或山坡陰處，野生資源較為豐富[1]。烏蘇里瓦韋富含黃酮類、皂苷類、有機酸類及甾體類等成分[2]，綠原酸、葉黃素、蛻皮甾酮和黃酮類物質是其主要藥效物質基礎[3]。烏蘇里瓦韋味苦、性平、無毒，具有清熱解毒、利尿、止血、消腫等功效[4]。現代藥理學研究表明，其有抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化等活性[5-6]。民間廣泛用于治療小便不利、小便淋痛、水腫、尿血、咽喉腫痛、濕熱痢疾、瘡瘍腫毒、刀傷出血等多種病癥，也將其制成茶葉用于治療各種炎癥疼痛[7-9]。

為進一步開發利用該藥用植物，本試驗對其進行了活性篩選。根據文獻報道，烏蘇里瓦韋抗小鼠耳廓腫脹活性的藥效物質可能是黃酮類以及酚酸類物質[10]，故本課題組以95%乙醇進行回流提取，獲得了含量較高的總黃酮和總酚酸類物質，并首次通過氨水引咳和酚紅排泌等經典模型研究了烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物的鎮咳和祛痰作用，繼而采用氣管注射脂多糖（LPS）造成急性呼吸道炎癥模型以探討提取物是否通過抗炎機制而發揮藥理作用。

1 材料、儀器

1.1 材料

烏蘇里瓦韋采于吉林省磐石市煙筒山鎮和平屯東山，經吉林大學藥學院李平亞教授鑒定為蕨類水龍骨科植物烏蘇里瓦韋（L.ussuriensis）的全草，存放于吉林大學再生醫學研究所新藥研發標本室。烏蘇里瓦韋95%乙醇回流提取物由本實驗室自制，紫外-可見分光光度計測定物質含量，其中，總黃酮15.8%、總酚酸8.7%。試驗前，用純凈水配制成0.16g/mL、0.08g/mL、0.04g/mL的溶液。

SPF 級ICR 小鼠130 只，雌、雄各半，（20±2）g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，合格證號：SCXK（吉）-2016-003。室溫22 ℃～24 ℃、相對濕度55%～65%環境中飼養，自由采食飲水。

枸櫞酸噴托維林片（國藥準字號：H12020234，批號：1611014，天津力生制藥股份有限公司，灌胃前用純凈水制成2.5 mg/mL 的溶液）；脂多糖（LPS，批號：O0808A，大連美侖生物技術有限公司）；腫瘤壞死因子-（TNF-）ELISA 檢測試劑盒（批號：201802，上海諾淵生物科技有限公司）；小鼠白細胞介素1（IL-1 ）和小鼠白細胞介素6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（批號：20171220-4812，武漢華德試劑有限公司）。

碳酸氫鈉（NaHCO3，批號：20180110，北京化工廠）；酚紅（批號：C10115997，上海麥克林生化科技有限公司）；氨水（批號：171008001，西隴科學股份有限公司）；10%水合氯醛（批號：20150312，沈陽市試劑三廠）。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

FA1104N 電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；TGL-16-aR 高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；722 紫外-可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；BIO-RAD酶標儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。

2 試驗方法

2.1 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對氨水引咳模型小鼠的影響

小鼠適應性飼養7 d 后，放入鐘罩內，再將重量、形狀基本一致的棉球放入鐘罩內，迅速向棉球中注入1.0 mL 25%的濃氨水，密閉20 s 后取出小鼠，以小鼠抬頭、張嘴并伴有腹肌收縮等咳嗽動作者即為咳嗽1次[11]。從取出小鼠后開始計時，記錄小鼠的咳嗽潛伏期和3 min 內的咳嗽次數，剔除3 min 內不咳嗽的老鼠[12-13]。

將挑選好的50 只小鼠按性別、體重隨機分為5 組，即空白對照組、陽性對照組（枸櫞酸噴托維林25 mg/kg）、烏蘇里瓦韋高劑量組（1.6 g/kg）、烏蘇里瓦韋中劑量組（0.8 g/kg）、烏蘇里瓦韋低劑量組（0.4 g/kg），每組10 只。各組小鼠灌胃給藥（10 mL/kg），空白對照組灌胃給予純凈水，連續給藥7 d，每天灌胃給藥1 次。末次給藥1 h 后，按上述方法測定小鼠的咳嗽潛伏期和3 min 內的咳嗽次數[14]。

2.2 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對小鼠氣管段酚紅排泌的影響

準確稱取10 mg 酚紅，加5%NaHCO3 溶液100 mL溶解，依次稀釋為0.1g/mL、0.3g/mL、0.5g/mL、0.7g/mL、1.0g/mL、3.0g/mL、5.0g/mL、7.0g/mL、10.0g/mL 的溶液，546 nm 處測定吸光度[15]，以酚紅濃度為橫坐標（X）、吸光度（Y）為縱坐標做標準曲線，得回歸方程：Y=0.126X+0.037 7（r2=0.999 3）。

ICR 小鼠50 只，雌、雄各半，適應性飼養7 d，分組、給藥同“2.1”項下方法。末次給藥1h 后，每只小鼠腹腔注射（20 mL/kg）2.5%酚紅生理鹽水溶液，注射30 min后脫頸椎處死小鼠，鈍性剖離氣管周圍組織及食道，充分暴露出氣管，用止血鉗夾住自甲狀軟骨至氣管分叉處的氣管兩端，防止氣管內的液體流出。將氣管剪下后，用生理鹽水清洗氣管表面殘留的血液，加0.5%NaHCO3溶液2mL，超聲10min，3000r/min離心5 min，取上清液于546 nm 處測定吸光度值[11]。

2.3 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對急性炎癥小鼠IL-6、IL-1及TNF-的影響[16]

ICR小鼠30 只，雌、雄各半，適應性飼養7 d，隨機分為正常對照組、模型組、烏蘇里瓦韋高劑量組（1.6g/kg）3 組。各組小鼠均連續灌胃給藥7 d，末次給藥1 h 后，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛（5mL/kg）麻醉。正常對照組小鼠麻醉后不作處理，給藥組和模型組小鼠仰臥位固定，用鑷子捏起頸部皮膚，于頸正中線剪一小口，暴露皮下組織，用無菌棉棒鈍性分離頸部軟組織和肌肉，露出氣管，向氣管內緩緩注入LPS 溶液100L（10 mg/Kg），隨后立即豎立小鼠，并旋轉體位以便于LPS 溶液在肺內進行全面的分布，創口縫合，碘伏消毒；2 h 后，小鼠眼眶取血，3 000 r/min（4 ℃）離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書方法測定血清中IL-6、IL-1 及TNF-的含量。

2.4 數據處理

3 試驗結果

3.1 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對氨水引咳模型小鼠的影響

與空白對照組比較，烏蘇里瓦韋提取物高、中劑量組的咳嗽潛伏期明顯延長，咳嗽次數明顯減少（P ＜0.01，P＜0.05），與陽性藥枸櫞酸噴托維林具有類似的作用；烏蘇里瓦韋提取物低劑量組未見明顯作用。見表1。

表1 烏蘇里瓦韋對小鼠氨水引咳潛伏期和咳嗽次數的影響Table 1 Effects of L.ussuriensis on the mice ammonia induced cough latency and cough times （n=10，±s）

表1 烏蘇里瓦韋對小鼠氨水引咳潛伏期和咳嗽次數的影響Table 1 Effects of L.ussuriensis on the mice ammonia induced cough latency and cough times （n=10，±s）

注：與空白對照組比較，*.P ＜0.05；**.P ＜0.01。下表同。Note:Compared with the blank control group,*.P ＜0.05;**.P ＜0.01.The table below is the same.

組別Group name劑量Dose引咳潛伏期（s）Coughing latency咳嗽次數Cough times空白對照組 Blank control group - 2.62±0.89 29.80±18.98枸櫞酸噴托維林組 Pentoxyverine group 25mg/kg 4.29±1.46** 12.40±2.50**烏蘇里瓦韋高劑量組 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 6.05±3.26** 11.20±6.01**烏蘇里瓦韋中劑量組 L.ussuriensis medium dose group 0.8g/kg 4.12±2.04* 16.60±5.58*烏蘇里瓦韋低劑量組 L.ussuriensis low dose group 0.4g/kg 2.16±1.08 35.80±16.86

3.2 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對小鼠氣管段酚紅排泌的影響

隨著小鼠氣管內分泌的粘液增加，氣管內的酚紅排泌量也增多[15]。與空白對照組比較，烏蘇里瓦韋高、中劑量組可使小鼠氣管酚紅排泌量明顯增加，具有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組無統計學意義。見表2。

表2 烏蘇里瓦韋對小鼠氣管段酚紅排泌的影響Table 2 Effects of L.ussuriensis on phenol red secretion in mice tracheal segments （n=10，±s）

表2 烏蘇里瓦韋對小鼠氣管段酚紅排泌的影響Table 2 Effects of L.ussuriensis on phenol red secretion in mice tracheal segments （n=10，±s）

組別 Group name 劑量Dose酚紅排泌量（ g/mL）Phenol red excretion空白對照組 Blank control group - 0.37±0.13枸櫞酸噴托維林組 Pentoxyverine group 25mg/kg 0.55±0.17*烏蘇里瓦韋高劑量組 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 0.56±0.25*烏蘇里瓦韋中劑量組 L.ussuriensis medium dose group 0.8g/kg 0.49±0.11*烏蘇里瓦韋低劑量組 L.ussuriensis low dose group 0.4g/kg 0.45±0.17

3.3 烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物對小鼠IL-6、IL-1及TNF-的影響

炎癥反應是當機體受到外界損傷或致炎因素刺激時，單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞被激活，在受損部位大量聚集，產生一系列的炎性細胞因子，包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和TNF-等[17-18]，其中，最為主要的促炎因子有IL-6、IL-1和TNF-等。

將LPS 注入氣管內后，與正常對照組比較，模型組血清中IL-6、IL-1及TNF-的含量明顯增加，具有統計學意義（P ＜0.01），表明小鼠急性炎癥模型造模成功。

表3 烏蘇里瓦韋對小鼠IL-6、IL-1 及TNF- 的影響Table 3 Effects of L.ussuriensis on IL-6,IL-1 and TNF- in mice （n=10，±s）

表3 烏蘇里瓦韋對小鼠IL-6、IL-1 及TNF- 的影響Table 3 Effects of L.ussuriensis on IL-6,IL-1 and TNF- in mice （n=10，±s）

組別 Group name 劑量 Dose IL-6 IL-1 TNF-空白對照組 Blank control group - 8.95±1.36 11.16±1.82 58.54±3.14模型對照組 Model control group - 11.49±1.15** 12.80±2.41** 105.86±28.04**烏蘇里瓦韋高劑量組 L.ussuriensis high dose group 1.6g/kg 10.10±0.69** 11.71±1.74* 69.20±4.07*

4 討論

咳嗽作為呼吸道常見癥狀，具有清除呼吸道異物和分泌物的保護性作用。常用的鎮咳藥理活性研究模型包括氨水引咳法、SO2 引咳法、辣椒素引咳法、豚鼠枸櫞酸引咳法[19，20]。其中，以氨水引咳法最為經典，故本試驗采取該法測定烏蘇里瓦韋的鎮咳作用。

痰液是呼吸道受炎癥因子侵入時，纖毛運動減慢，粘膜上皮受損，黏蛋白分泌異常增加，積累粘液而引起的痰狀物質。祛痰藥可使痰液變稀而易于咳出，主要是通過改善咳嗽清除率和黏液纖毛系統清除率來祛痰[21]。常用的祛痰藥理活性研究模型包括氣管酚紅排泌法、毛細玻管法[22]。其中，氣管酚紅排泌法是利用酚紅能夠部分從氣管排泌的特點，準確性好、可操作性強，主要針對小鼠；毛細玻管法主要針對大鼠，故本試驗采取該法考察烏蘇里瓦韋的祛痰活性。

IL-6 為活化的T 細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子，是能使B細胞前體成為產生抗體的細胞，又名B細胞刺激因子，在被TNF-和IL-1誘導后，通過激活炎性介質來調節急性炎癥反應及免疫功能等[23]。IL-1是免疫細胞在免疫應答時產生的細胞因子，能夠刺激T 細胞產生IL-2，在免疫應答和組織修復中起重要作用，有IL-1和IL-12 種形式，其中，IL-1又名前炎性反應細胞因子、淋巴細胞活化因子，能通過多種生物學功能參與免疫應激和信號傳導，在受到致炎因素刺激時較短時間內可促使炎癥的級聯反應的發生，幾小時內便可達到峰值[24]。TNF-是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一，在炎性細胞的增殖、分化中起到重要的中介作用。有研究證實，血清中TNF-的含量與急性肺損傷的嚴重程度呈正相關[25]。本試驗中選用IL-6、IL-1和TNF-作為指標成分以判斷烏蘇里瓦韋是否具有抗炎作用，進而判斷其是否通過抗炎而發揮鎮咳和祛痰的藥理作用。抗炎藥理活性研究中，LPS 的常用給藥方式有腹腔注射法、氣管內滴入法、氣管內注射法和氣管內霧化法等，其中，氣管內霧化法缺少相關實驗器材，氣管內注射法相比腹腔注射靶向性更強，相比于滴入操作更簡便[16]，故本試驗采取該法考察烏蘇里瓦韋的祛痰活性。

藥用植物烏蘇里瓦韋具有清熱解毒、利尿消腫、止咳止血等功效，具有較好的抗小鼠耳廓腫脹的作用，但未見其鎮咳和祛痰作用的研究。為開發防治呼吸系統疾病的中草藥提供理論數據，本試驗以烏蘇里瓦韋95%乙醇提取物（總黃酮15.8%、總酚酸8.7%）為樣品，研究了其對小鼠的鎮咳和祛痰作用，并初步探討了其作用機制。實驗結果表明，烏蘇里瓦韋提取物高、中劑量組能夠延長氨水誘導的小鼠咳嗽潛伏期，同時顯著減少單位時間內咳嗽次數，并能夠顯著促進小鼠氣管酚紅的排泌量，表明其具有較好的鎮咳和祛痰作用。在機制的初步探討中發現，鎮咳和祛痰作用最為顯著的烏蘇里瓦韋高劑量組能夠明顯降低LPS誘導的ICR小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-的含量，提示鎮咳和祛痰作用可能與抑制血清中的炎癥因子和TNF-有關。